21 век – время грандиозных по своему масштабу открытий в медицине. Изобретение новых препаратов для лечения гемофилии, вакцин, гормонов, иммунокоррегирующих веществ, расшифровка человеческого генома, – далеко не весь перечень научных открытий, созданных с помощью генной инженерии. Достижения генной инженерии в эндокринологии вот уже более 20 лет остаются в центре внимания медицинского сообщества в связи с тем, что распространение сахарного диабета (СД) в последние годы получило характер эпидемии. По данным Международной федерации диабета в 2014 г. в мире зарегистрировано 387 млн больных, ожидается, что к 2035 г. их количество увеличится до 592 млн. Только в РФ насчитывается 3,5 млн больных сахарным диабетом, однако в реальности это число может достигать 9 млн человек. [4]
Результаты генно-инженерных исследований, от производства рекомбинантного человеческого инсулина до имлантации инсулин-продуцирующих клеток, полученных из собственных клеток пациента, позволяет полагать, что разработка ряда эффективных методов лечения инсулинозависимого СД становится реальностью.
Открытие инсулина Ф. Бантингом и его коллегами в 1921 г. привело к значительному прогрессу в лечении инсулинозависимого СД: продолжительность жизни после постановки диагноза увеличилась с 1,3 года до 45 лет. Однако, успешное лечение СД очищенным бычьим инсулином сопровождалось неблагоприятными побочными эффектами: воспалением, формированием абсцессов в месте введения, в дополнение к потенциально смертельным аллергическим реакциям, а недостаточная степень очистки приводила к ошибкам в дозировании препарата. Несмотря на это, очищенный бычий инсулин был основным препаратом для лечения СД вплоть до начала 1980 годов. В то же время стремительно стала развиваться генная инженерия, позволяющая конструировать рекомбинантные ДНК вне биологических систем (in vitro), а затем вводить их в геном другого организма. [2]
В основе получения человеческого инсулина также лежит использование методов генной инженерии. Аминокислотная последовательность человеческого инсулина была разработана Фредериком Сенгером еще в 1958 г. Как известно, инсулин состоит из двух пептидных цепей А и В, связанных двумя дисульфидными мостиками между аминокислотами цистеина, присутствующими в этих двух цепях, третий дисульфидный мостик находится в цепи А. Уже через 20 лет человеческий инсулин был создан с помощью технологии рекомбинантной ДНК. Рекомбинантный человеческий инсулин синтезируется методом внедрения ДНК каждой цепи инсулина отдельно в ДНК ослабленных неинфекционных штаммов бактерий E.coli. После многократных циклов деления, бактерии могут производить множество копий каждой цепи инсулина. Индивидуальные цепи молекулы инсулина извлекают из бактерий и очищают. После очистки молекулы рекомбинантного инсулина, для улучшения её функции, проводят замещение одной аминокислоты в молекуле. Эти изменения способствуют производству инсулина быстрого или длительного действия. Рекомбинантный человеческий инсулин, получаемый с использованием в E.coli и Saccharomyces cerevisiae, не вызывает опасных побочных эффектов, отмечаемых при использовании инсулина животного происхождения.
Более эффективный метод, также с использованием E.coli, включает в себя производство проинсулина, а не отдельных фрагментов его синтеза. Как известно, синтез инсулина in vivo и его выделение представляют собой сложный многоэтапный процесс. Первоначально образуется неактивный предшественник гормона, проинсулин, который после ряда химических превращений переходит в активную форму. В процессе созревания из молекулы проинсулина с помощью специфических эндопептидаз вырезается C-пептид — фрагмент из 31 аминокислоты, соединяющий B-цепь и A-цепь, таким образом молекула проинсулина разделяется на инсулин и биологически инертный пептидный остаток. Ген, кодирующий проинсулин, трансфицируют в клетки E.coli, где он в дальнейшем экспрессируется. Полученный гормон очищается, а цепь С протеолитически удаляется. [5]
Привлекательной системой экспрессии, которая может быть использована для производства инсулина в промышленных масштабах для терапевтического применения у человека как в парентеральной, так и в пероральной и ингаляционной формах, являются трансгенные растения. Рекомбинантный человеческий инсулин успешно экспрессируется и продуцируется в масличных культурах Резуховидки Таля (Arabidopsis thaliana). Эта технология включает целенаправленную экспрессию инсулина в субклеточных структурах, известных как oilbodies, которые состоят из гидрофобного ядра триацилглицерина, заключенного в капсулу из фосфолипидной мембраны и наружной оболочки протеинов, известных как олеозины. Затем oilbodies отделяются от других компонентов семян, и рекомбинантный инсулин отщепляют от ассоциации с олеозином. Последующее созревание для получения биологически активного инсулина может быть осуществлено с использованием стандартных ферментативных методов. Масличные могут также выступать в качестве естественного клеточного склада, где рекомбинантный инсулин может быть складирован до тех пор, пока потребуется. [6]
В других исследованиях были получены трансгенные растения, в которых человеческим проинсулином трансформировали хлоропласты табака и салата-латука. Обнаружено, что листья табака накапливают до 47%, а листья салата до 53% проинсулина от общего белка листьев. Проинсулин, содержащийся в листьях салата оказался очень стабильным, около 40% проинсулина обнаруживается даже в стареющих и высушенных листьях. Затем проинсулин экстрагируют и расщепляют с помощью протеаз. Доказано, что пероральное введение мышам необработанного проинсулина, инкапсулированного в растительной клетке, приводит к снижению уровня глюкозы в крови, подобно введению коммерчески доступных инсулинов. При этом получение инсулина с использованием трансгенных растений обладает рядом преимуществ: экономическая эффективность, отсутствие человеческих патогенов, простота производства и наличие эукариотической машин для посттрансляционных модификаций. [7]
Не менее интересны эксперименты по производству высоких уровней человеческого проинсулина в молоке трансгенных мышей, несущих кДНК человеческого инсулина с экпрессией, приводимой в действие промотором гена - козьим β-казеином. Уровень экспрессии человеческого проинсулина в молоке была максимальной в средине лактации и достигала 8,1 г/л. При этом уровни глюкозы в крови и уровни инсулина, так же как и состав молока были неизменными, и трансгенные животные не имели видимых дефектов здоровья. Зрелый инсулин, полученный из проинсулина молока сохранял свою биологическую активность. [8]
Исследования последних лет направлены на поиск возможности замещения утраченной функции инсулярного аппарата, нормализации регуляции углеводного обмена и полный отказ от экзогенного введения инсулина. Реальную возможность излечения от СД 1 типа дает аллогенная трансплантация островков поджелудочной железы: гистологически подтверждено, что островки человека, трансплантированные в печень, способны к выживанию в течение нескольких лет при отсутствии признаков отторжения и рецидива аутоиммунного процесса. Однако, для успешной функции пересаженной островковой ткани в портальную систему необходимо ввести достаточное количество островков, способных секретировать инсулин в среде с гипергликемией: высокая эффективность этого метода была продемонстрирована при пересадке более 11000 островков на 1 кг массы тела больного.
Другие проблемные аспекты – это необходимость проведения иммуносупрессивной терапии, тестирование доноров на вирусы гепатита, ЦМВ и ВИЧ инфекцию, защита островков от бактериальной и грибковой контаминации. [3]
Реальной альтернативой аллогенной трансплантации является генная терапия, позволяющая направленно изменять генные дефекты путем введения нормальных генов в клетки пациентов. Для эффективной доставки чужеродного гена в клетки-мишени используют вирусные векторы, обладающие способностью к активной трансдукции и длительной экспрессии чужеродного гена. В качестве клеток - мишеней используются лимфоциты, клетки красного костного мозга, опухолей, печени и др. [1]
В последнее время предпринимаются попытки разработать генетическую конструкцию, способную автономно функционировать по принципу «обратной связи» и секретировать адекватное содержанию глюкозы количество инсулина. В эксперименте получен клон иммортализированных β -клеток островков Лангерганса, трансфицированных геном р-галактозы, который в течение 9 мес. способен был секретировать инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой. Такие «инженерные» β-клетки сохраняли свою функциональную активность при подкожном, внутрикожном и внутримышечном введении экспериментальным животным. Методом селекции клеток инсулиномы был получен усовершенствованный клон, резистентный к -интерферону и интерлейкину-1 β, опосредующим иммунный ответ.
На 61 конгрессе Американской диабетической ассоциации сообщалось о возможности генно-инженерных конструкций осуществлять контроль экспрессии гена инсулина в нейроэндокринных клетках кишечника. В исследовании с экспериментальным СД у крыс модифицированная кДНК проинсулина человека вместе с аденоассоциированным вирусным вектором помещалась в специальную кассету. Через 6-8 часов после перорального приема этой кассеты у диабетических животных отмечалось снижение глюкоземии, затем длительно сохранялось эугликемическое состояние, опосредованное, вероятно, трансдукцией гепатоцитов. Продемонстрирована также возможность использования в качестве продуцентов инсулина генетически измененных печеночных клеток. При помощи вектора ЦМВ в гепатоциты HEP G2 и HUH7 введена кДНК инсулина человека. Трансфицированные клетки секретировали проинсулин человека, адекватно изменению уровня глюкозы. После имплантации диабетическим мышам они продолжали продуцировать инсулин, обеспечивая нормальное содержание глюкозы сыворотки крови. [3]
Открытие белка, являющегося транскрипционным фактором (PDX-1 или IDX-1/STF-1/IPF-1), контролирующим развитие поджелудочной железы и транскрипцию гена инсулина является еще одним толчком для генной терапии СД. Фактор PDX-1 экспрессируется не только в период эмбриогенеза, но и во взрослом состоянии, что сопровождается неогенезом островков и дифференцировкой инсулинпродуцирующих (ИПК) клеток из прогениторных клеток. Предложено использование экзогенного PDX-1 для стимуляции транскрипции гена инсулина и дифференцировки под его влиянием in vitro и in vivo стволовых панкреатических клеток человека в ИПК. Превращение инсулинпродуцирующей стволовой клетки (ИПСК) в ИПК достигалось путём последовательного многостадийного воздействия на клетки факторов цитодифференцировки, при этом отмечалась экспрессия панкреатических генов PDX1 и NKX6-1. Такие клетки были способны выбрасывать кальций в ответ на добавление в среду глюкозы, упаковывать инсулин в секреторные гранулы, секретировать инсулин в количествах, близких с таковыми у зрелых β-клеток, в ответ на множественные эпизоды добавления глюкозы. В экспериментах in vivo ИПК после трансплантации диабетическим мышам проявили способность контролировать уровень глюкозы в крови.
В настоящее время интенсивно ведутся разработки устройства ViaCyte, предоставляющего собой макроконтейнер со средой для развития, поддержки и обеспечения жизненных потребностей ИПК, обладающий полупроницаемыми стенками, способными пропускать инсулин, кислород и питательные вещества, но препятствующими проникновению клеток. Данный эффект обеспечивает, как протекцию трансплантированных клеток от аутоиммунной атаки, так и защиту организма реципиента от их потенциально возможного туморогенного действия. Сообщается о разрешении FDA на начало клинических испытаний по трансплантации ViaCyte как перспективного вида СД 1 типа без подавления иммунитета и без риска гипогликемии и других осложнений, связанных с диабетом [4].
Подытоживая вышесказанное, можно отметить, что результаты исследований в сфере генной инженерии позволяют не только удовлетворить потребности в инсулине больных СД 1 типа, нуждающихся в заместительной терапии, но и делают возможным возобновление утраченных функций инсулярного аппарата и нормализацию углеводного обмена и его регуляции.