Введение
Лизосомные болезни накопления (LSDs – англ. Lysosomal storage diseases) – группа редко встречающихся наследственных заболеваний, вызываемых генетически обусловленным дефектом лизосомных гидролитических ферментов, клеточных транспортеров и белков, входящих в состав мембран. В конечном счете это приводит к накоплению макромолекул и метаболитов в клетках, а как следствие к повреждению отбельных тканей, органов и систем организма. Болезни накопления являются следствием первичной генной мутации.
Известно уже более 50 разновидностей LSDs, и традиционно они классифицируются согласно химическим свойствам накопленного комплекса. Отдельные случаи LSDs встречается не чаще, чем у одного из 100 тысяч новорождённых, при этом распространённость конкретного заболевания в различных популяциях может значительно варьироваться [12].
Большинство LSD наследуются аутосомно-рецессивно, за исключением заболеваний, которые наследуются сцеплено с X хромосомой. К ним относятся мукополисахаридоз Хантера (МПС II) и болезнь Фабри, являющиесяся рецессивными Х-сцепленными заболеваниями, а также синдром Данона, являющийся доминантным Х-сцепленным заболеванием.
Заболевания характеризуются тяжестью последствий с точки зрения здоровья пациентов, социальных и экономических затрат. LSD затрагивают многие ткани и органы, поэтому для них характерна множественность внутренних, соматических и неврологических проявлений. Среди клинических проявлений, связанных с центральной нервной системой, чаще можно встретить прогрессирующие нейродегенеративные заболевания и умственную отсталость [2, 5].
Мультиполярнось фенотипических проявлений LSD и их патофизиология представляют определенную сложность для терапевтических вмешательств. Способы лечения должны быть направлены как на устранение причины заболевания, на восстановление пораженных органов, так и на повышение качества жизни пациентов. Начиная с конца 20 века было внедрено много терапевтических методов, однако у данных подходов есть ограничения, и важные проблемы остаются нерешенными. Кроме того, у каждого из доступных подходов есть строгие признаки и критерии применимости для отдельного LSD, или даже для отдельных пациентов. В принципе, ни у одного из вариантов нет возможности устраняя
ить все заболевания, поэтому в текущих условиях все силы направлены на поиски альтернативных терапевтических подходов для лечения LSDs на основе инновационных стратегий [3, 14].
Существует три основные научные стратегии в лечении LSD, которые ориентированы на снижение концентрации патологического субстрата, восстановление и поддержание конформации поврежденного белка, либо на устранение первопричины – генетической мутации.
- Воздействие на патологический субстрат
Стратегия воздействия на патологический субстрат заключается в двух подходах: химическая модификация продукта накопления и снижение синтеза субстрата. Модификация продукта применяется в том случае, если происходит повреждение транспортных систем лизосом [3, 6]. Химическое превращение накопившегося субстрата позволяет получить такое вещество, которое может без трудностей выходить из лизосом через их мембранные переносчики. Данный механизм лежит в основе лечения цистиноза. Цистиноз - редкое аутосомно-рецессивное заболевание, причиной которого является мутация в гене CTNS, кодирующем лизосомальный переносчик цистина. При этом заболевании в различных органах и тканях происходит накопление цистина в лизосомах и отложение его кристаллов. Для лечения данной поталогии используется цистеамин – единственное вещество, являющееся супрессором отложения цистина внутри лизосом. Препарат проникает в органеллу, где расщепляет цистин на две молекулы цистеина и затем соединяется с одной из них с помощью дисульфидной связи. Образующиеся при этом цистеин-цистеаминовый комплекс и цистеин не нуждаются в цистинозине для выхода из лизосомы. Дисульфидное соединение, являющееся аналогом лизина, переносится через лизиновый транспортер [6].
Большинство известных на данный момент групп LSDs связаны со сбоем определенных стадий катаболизма (мукополисахаридозы, гликосфинголипидозы и т.д.), и их патогенетические механизмы обусловлены накоплением в клетках нерасщепленного субстрата [16]. Методика снижения синтеза субстрата применяется в том случае, если сохраняется малая активность дефектного фермента. При субстратредуцирующей терапии происходит снижение катализируемого вещества, этим путем достигается равновесие между синтезом субстрата и его диссимиляцией. Об успешности данного метода заговорили, когда были получены положительные результаты на животных моделях болезни Тея–Сакса и Сандхоффа. Использование данной методики приводило к снижению концентрации субстрата в центральной нервной системе и, как следствие, к уменьшению степени выраженности симптомов заболевания. В последующем подобные эксперименты проводили на животных моделях болезни Гоше типа I, где также был достигнут положительный эффект [1, 5].
- Коррекция функций измененного фермента
Большинство терапевтических подходов при лечении LSDs направлено на восстановление потерь измененного энзима путем увеличения его содержания в клетках и тканях.
К данным методикам относится фермент-заместительная терапия (ФЗТ), которая в прошлом являлась огромным рывком в лечении LSDs, а на данный момент является стандартом коррекции многих заболеваний (болезнь Гоше, Фабри, Помпе и мукополисахаридозы). Обоснования эффективности ФЗТ развивались с момента обнаружения молекулярных механизмов, которые участвуют в сортировке и распределении синтезируемых ферментов. ФЗТ основывается на концепции, согласно которой лизосомные гидролазы могут усваиваться клетками и тканями через маннозный или манноза-6-фосфатный транспортер, затем проникают в лизосомы, где восполняют функцию дефектного энзима [8]. Еще одним толчком для эволюции заместительной терапии стало развитие технологий, позволяющих производить очистку и разнообразные манипуляции с энзимами для их нацеленной доставки в клетки и ткани.
Несмотря на успехи применения, ФЗТ имеет определенные ограничения. Основные трудности заключаются в распределении ферментов, так как белковые молекулы имеют большие размеры и не могут свободно проходить через биологическую мембрану. В большинстве случаев рекомбинантные энзимы не могут проходить через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). В связи с этим терапия не оказывает влияние на неврологические проявления заболевания. Здесь как альтернативный способ доставки препаратов в центральную нервную систему может быть применен интратектальный путь введения. В качестве другого метода преодоления ГЭБ были предприняты попытки химической модификации b-глюкуронидазы (при дефекте этого фермента развивается МПС VII типа). Измененные молекулы отменяли маннозный и маннозо-6 фосфатный путь поглощения фермента, в результате происходило накопление фермента в плазме крови и увеличение его доставки к клеткам головного мозга через неизвестный путь [11].
Также существует проблема целенаправленной доставки фермента. Так при болезни Помпе наблюдается метаболическая миопатия в результате дефицита кислой α-1,4-глюкозидазы. Действие лечебного фермента направлено на коррекцию деятельности основных пунктов потребления – сердце и мышцы, но это представляет определенную сложность, так как большая часть энзима будет захвачена печенью и только незначительная часть препарата доставляется в мышцы. На эффективность ФЗТ также могут влиять аспекты патофизиологии и вторичные клеточные нарушения, вызванные накоплением субстрата. К тому же побочным эффектом введения рекомбинантных ферментов ослабленным пациентам может служить иммунный ответ. Следует отметить и то, что для поддержания устойчивого уровня корректирующих ферментов необходимо постоянное проведение инъекции или установка имплантируемой венозной порт-системы. Не стоит игнорировать и экономический аспект вопроса. Лечение одного больного может обойтись в несколько сотен тысяч долларов [7].
Применение ФЗТ основано на экзогенном введении препаратов, но применяются и методы, направленные на эндогенное замещение энзимов путем пересадки стволовых клеток – трансплантация костного мозга. Практически для всех LSDs был опробован данный терапевтический метод, но большинство экспериментов касаются лишь единичных случаев и, в большинстве случаев, это не приводило к коррекции всех осложнений заболевания. Первое заболевание, для которого была проведена ТКМ, и достигнуты наилучшие результаты – МПС I типа [5, 14]. Эффективность лечения зависит от сроков начала процедуры и является продуктивным до 2 лет, когда поражение центральной нервной системы не столь существенно. После пересадки гемопоэтических клеток у пациентов наблюдается восстановление собственной активности ферментов до нормальных значений и снижение уровня экскреции глюкозаминоглюканов, до уровня верхней границы нормы для данного возраста [1]. Существуют и проблемы в применении данного метода. Они заключаются в высоком риске данной манипуляции, в сложности подбора донора и в посттрансплантационных осложнениях, однако ТКМ остается на сегодняшний день стандартным методом лечения МПС I типа.
Для лечения других LSDs роль трансплантации гемопоэтических клеток менее доказана или противопоказана пациентам с тяжелыми нейродегенеративными формами. В перспективе рассматривается применение мезенхимальных и других стволовых клеток костного мозга, а также сочетание ТКМ с другими методами лечения [5, 14].
В последние годы изучается новый подход к лечению LSDs, основанный на использовании низкомолекулярных соединений - фармакологических шаперонов. Точечные мутации часто приводят к нарушению фолдинга белков, в результате чего ферменты не способны сохранять свою нативную структуру и это приводит к угнетению их функций. В клетке существует система, отвечающая за контроль качества вновь синтезируемых белков. Она сосредоточена в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) и состоит из молекул-шаперонов, которые способствуют правильной конформации протеинов и «датчиков» молекул, распознающих белок с нарушенной нативной структурой. Таким образом, правильно сложенные белки отправляются в цитоплазму, а мутантные запускают серию реакций, направленных на их утилизацию в ЭР-связанных комплексах дегенерации [13,14].
При генетических патологиях нонсенс мутации или мутации со сдвигом рамки считывания приводят к синтезу укороченной молекулы белка, которая не обладает каталитической активностью. Однако некоторые мисенс-мутации и небольшие делеции без сдвига рамки считывания не затрагивают активный центр ферментов или участок связывания и приводят к нарушениям пространственной конформации [5, 13. 14]. Ряд веществ могут служить стабилизаторами белков, помогая образовать устойчивую структуру и пройти «пункт контроля». Эти соединения получили название «фармакологических шаперонов» по аналогии с белками «шаперонами», участвующими в фолдинге протеинов. Идея терапии фармакологическими шаперонами базируется на концепции, что лиганды, такие как субстраты, кофакторы, неконкурентные ингибиторы, могут помочь в построении дефектного фермента и сохранить его каталитическую активность [10]. Результатом подобного механизма является увеличение внутриклеточного пула активных ферментов и частичное восстановление метаболизма.
В качестве фармакологических шаперонов было предложено использование низкомолекулярных, чаще гидрофобных, молекул, стабилизирующих нативную конформацию специфических для них белков. В экспериментах in vitro было обнаружено, что некоторые соединения способны связываться с каталитическим центром энзима и поддерживать его структуру. Работа над культурами клеток с мутациями в гене α-галактозидазы (болезнь Фабри) показала, что при введении в культурную среду 1-deoxygalactonojirimycin в концентрациях близких к ингибиторным происходит стабилизация измененного фермента. Введение вещества трансгенным мышам с паталогией гена α-галактозидазы приводит к повышению активности энзима в сердце, почках, селезенке и других тканях [5, 10]. Данные результаты говорят нам о том, что конкурентные ингибиторы восстанавливают конформацию белка и обеспечивают его доставку в другие структуры клетки. Подобные наблюдения позволяют применять методику фармакологических шаперонов для многих заболеваний, связанных с мисенс-мутациями.
- Генотерапия
Целью генотерапии является доставка нормальной ДНК в клетки пациента и синтез утерянного фермента. В этих целях в лабораториях применяют различные вирусные векторы (ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы) и другие методики.
В основном исследование по применению вирусных векторов проводятся на животных моделях и дают положительные результаты. Так огромный потенциал показывает система переноса генов с применением аденоассоциированных вирусов (AAV). Впервые разработан и применен пожизненно был AAV 2 типа. Внутримышечные инъекции данного вектора проводились трансгенным мышам с моделью болезни Помпе, Фабри и МПС VII типа. В результате наблюдался высокий уровень активности дефектного фермента в инъецированной мышце, но относительно низкий или неопределяемый уровень в системе крови. Инъекции AAV-2 в паренхиму печени и мышцы взрослым мышам с МПС VII типа приводят к относительно высокому уровню экспрессии в тканях и снижению количества накопившегося субстрата. Однако такой подход обеспечивает лишь незначительные клинические улучшения [9, 15].
О значительных улучшениях при внутривенном введении вектора свидетельствуют биохимические, гистологические и клинические улучшения в нескольких мышиных моделях LSDs. Положительные изменения и сокращение накопившегося метаболита наблюдаются во многих тканях после внутривенного введения вектора AAV-2 у взрослых животных с МПС VII, болезнью Помпе и болезнью Фабри. Еще более впечатляющие результаты, такие как улучшение роста костей и развития скелета, нормальное функционирование органов зрения и слуха, наблюдаются у мышей с МПС VII после внутривенного введения вектора в неонатальный период. Исследования новорожденных доказали полезность раннего вмешательства для профилактики прогрессирующего заболевания [9, 15]. Гепотерапия является перспективным направлением в лечении LSDs, но существуют проблемы, которые еще предстоит решить в будущем.
Выводы:
Лизосомные болезни накопления – это обширная группа заполеваний, причинами которых являются мельчайшие сбои в молекулярной физиологии клеток. Существуют различные способы борьбы с данными дефектами, однако каждый из них имеет свои преимущества и недостатки. Современные технологи позволяют ученым все глубже познавать механизмы развития заболеваний и помогают им приблизиться к способам устранения дефектов. Различные методики (генотерапия, использование фармакологических шаперонов) являются будущим медицины и вскоре могут стать основными способами лечения лизосомных болезней накопления.