В настоящее время существует множество нерешенных биологических проблем, связанных с микроорганизмами, которые способны, как помогать жизнедеятельности человека, так и наносить вред. Созданы различные средства по борьбе с заболеваниями, которые вызывают микроорганизмы. Однако, прежде чем использовать эти разработки для борьбы с микробами, нужно исследовать их влияние на клетки человека. Это возможно благодаря методам определения жизнеспособности клеток. Данные методы можно применять как к микроорганизмам, так и к клеткам человека.
Цель исследования – провести сравнительную оценку методов определения жизнеспособности клеток.
МТТ-тест. Это колориметрический тест для оценки метаболической активности клеток. НАДФ-H-зависимые клеточные оксидоредуктазные ферменты могут, при определенных условиях, отражать количество жизнеспособных клеток. Эти ферменты способны восстанавливать тетразолиевый краситель 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид в нерастворимый формазан, который имеет пурпурное окрашивание. ХТТ - (2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2H-тетразолиум-5-карбоксанилид) был предложен в качестве замены MTT, давая большую чувствительность и более высокий динамический диапазон. Образующийся формазановый краситель растворим в воде, это позволяет избежать последнюю стадию растворения. Растворимые в воде соли тетразолиума – более поздние альтернативы MTT: они были разработаны путём введения позитивного или негативного заряда и гидроксильных групп в бензольное кольцо тетразолиевой соли или, ещё лучше, сульфонатных групп, которые добавляют бензольное кольцо прямо или опосредованно [9]. Восстановление тетразолиевого красителя зависит от НАДФ-H-зависимых оксидоредуктазных ферментов большей частью в цитозоле клетки. Именно поэтому восстановление МТТ и других тетразолиевых красителей зависит от клеточной метаболической активности из-за тока НАДФ-H. Клетки с низким уровнем метаболизма, как, например, тимоциты (клетки вилочковой железы) и селезёночные макрофаги восстанавливают очень мало MTT. Напротив, быстро делящиеся клетки показывают высокую степень восстановления MTT. MTT-тесты обычно выполняются в темноте, так как реагенты MTT чувствительны к свету [2, 8].
Метод суправитальной окраски раствором трипановой сини. Суправитальная окраска – окраска тканей, выделенных из организма и помещенных в условия, обеспечивающих протекание в них основных жизненных процессов. Hа предметное стекло наносят каплю взвеси клеток и 1 каплю 0,1% раствора трипановой сини. Через 30-60 с окрашенную каплю взвеси покрывают покровным стеклом. Избыток суспензии удаляют промакиванием фильтровальной бумагой и под микроскопом подсчитывают число живых (неокрашенных) и погибших (синих) клеток на 100 кариоцитов. Выводят процент гибели клеток. Раствор трипановой сини готовят заранее. Порошок растворяют в бидистиллированной воде из расчета получения 0,2% раствора, который фильтруют. Это маточный раствор. Рабочий раствор приготовляют перед опытом: маточный раствор разбавляют 4,25% раствором хлористого натрия до нужной концентрации (1 капля гипотонического физиологического раствора и 3 капли трипановой сини) [3, 4].
Метод проточной цитометрии. Проточная цитометрия – это уникальный метод определения жизнеспособности клеток, обеспечивающий качественный анализ клеток, который получил широкое применение в таких областях медицины, как иммунология, фармакология, цитология и др. Для изучения физиологического состояния клеток применяется оценка степени апоптоза. Данный метод позволяет проводить количественный подсчет апоптотических клеток. Поскольку не все типы клеток проявляют классические особенности апоптоза для того, чтобы проанализировать и определить механизм гибели, необходимо исследование множественных аспектов. Тем более, мультипараметрическая природа проточной цитометрии предусматривает сложный анализ, который предполагает возможность изучения нескольких апоптотических характеристик путем комбинирования соответствующих красителей в одном образце [1]. Проточная цитометрия осуществляется на специальных аппаратах – сортерах и проточных цитометрах. При проведении проточной цитометрии суспензия, приготовленная из клеток, предварительно помеченных флуоресцирующими моноклональными антителами или флуорохромами, помещается в поток дисперсионной среды, пропускаемый через проточную ячейку. Гидродинамическое фокусирование струи клеточной суспензии в струе дисперсионной среды приводит к тому, что исследуемые клетки или их ядра выстраиваются поодиночке и в таком порядке пересекают пучок сфокусированных световых лучей (обычно лазерных). Под воздействием определенных световых волн происходит одновременное возбуждение молекул разных флуоресцирующих красителей, что делает возможным анализ сразу нескольких параметров клеточных структур. Свет, исходящий из флуорохромов, фокусируют при помощи оптической системы, состоящей из нескольких зеркал и линз, а затем раскладывают на определенные компоненты. Полученные световые сигналы подвергают анализу и преобразованию в электрические импульсы, а затем – в определенные формы, приемлемые для компьютерной обработки и хранения полученной информации [5,7].
Биолюминесцентный метод определения внутриклеточного АТФ. Аденозинтрифосфат (систематическое название 9-β-D-рибофуранозиладенин-5’-трифосфат) – нуклеотид, трифосфорный эфир аденозина, который является производным аденина и рибозы, служит главным носителем химической энергии в клетках всех живых организмов. Содержание внутриклеточного АТФ является основным индикатором жизнеспособности клеток. При гибели клеток, в первую очередь, прекращается синтез АТФ, в то время как гидролиз АТФ может некоторое время продолжаться, поэтому содержание внутриклеточного АТФ быстро падает вплоть до нулевых значений. Существуют различные методы измерения концентрации АТФ: ферментативные со спектрофотометрической детекцией, радиоактивные, хроматографические и др. Однако, наиболее чувствительным, быстрым и специфичным является метод биолюминесцентной АТФ-метрии. Для регистрации биолюминесценции используются специальные приборы – люминометры. В современных приборах используется счетчик фотонов в комбинации с высокопроизводительными фотоумножителями (ФЭУ). Важно отметить, что сигнал, регистрируемый люминометром, пропорционален, но не равен числу фотонов, испускаемых образцом [6]. Следует отметить, что концентрация внутриклеточного АТФ в клетке может варьировать в зависимости от природы и размера клеток, и энергетического состояния. В зависимости от условий содержания культуры концентрация АТФ также может изменяться.
Заключение. Таким образом, среди рассмотренных методов самым простым в использовании является метод суправитальной окраски 0,1% раствором трипановой сини, т.к. он не требует наличия определенного оборудования, специальных навыков и позволяет получить результат в данный момент времени. Однако он не свидетельствует об истинной жизнеспособности клеток, а лишь отражает проницаемость плазматических мембран для этого красителя. Следовательно, метод суправитальной окраски 0,1% раствором трипановой сини нельзя применить ко всем клеткам и ко всем видам исследования. Также при проведении исследования с помощью МТТ-теста важно помнить, что, условия проведения теста могут изменять метаболическую активность клетки и таким образом получать восстановление тетразолиевых красителей без влияния на жизнеспособность клетки. Следует также отметить, что при использовании метода биолюминесцентного определения внутриклеточного АТФ важно помнить, что любые стрессовые факторы, например, температура, будут сильно влиять на количество внутриклеточного АТФ. Для наиболее точного определения жизнеспособности клеток желательно комбинировать различные методы и учитывать специфику каждого из них.