Введение. Эмаль зуба представляет собой уникальную высокоминерализованную ткань, состоящую из длинных параллельных кристаллов апатита, образующих эмалевые призмы. Энамелогенез осуществляется до прорезывания зуба, после чего способность образовывать новую эмаль теряется навсегда. Отсутствие естественных средств для регенерации эмали привело к тому, что на протяжении многих лет методы реставрационной стоматологии заключались в создании синтетических заменителей эмали (амальгамы, золота, фарфора, фотополимерных материалов). Однако в течение последних десятилетий разработаны инновационные методы культивирования клеток, имитирующие биологические аспекты энамелогенеза. Предложено несколько путей тканевой инженерии эмали: синтез эмали с использованием физико-химических средств, рост кристаллов эмали под действием белковой матрицы, реминерализация поверхности эмали, клеточная инженерия эмали и, наконец, биологическая регенерация эмали, основанная на индукции de novo морфогенеза зубов[1].
Цель исследования: изучить литературные данные о возможностях биоинженерии эмали.
Материал и методы исследования: контент-анализ литературных источников.
Результаты исследования и их обсуждение. Как известно, в начале своего развития одонтогенный эпителий образует эмалевый орган (ЭО), который затем формирует коронку зуба и шеечную петлю [2]. Коронковая часть ЭО дифференцируется в четырехслойную «шапочку», внутренний слой которой расположен на границе с дентинобластами и представлен преэнамелобластами. Клетки шеечной петли образуют мощную клеточную оболочку, которая определяет форму корня зуба. Секреция дентина является пусковым моментом для дифференцировки преэнамелобластов в секреторные Eb, которые образуют белковый матрикс эмали и осуществляют его последующую минерализацию [3]. Одновременно происходит изменение полярности клеток, в результате базальный и апикальный полюсы меняются своими местами. Комплекс Гольджи и центриоли смещаются к полюсу, обращенному к дентинобластам, ставшему теперь апикальным, а митохондрии и ядро локализуются в базальной части клетки, обращенной к промежуточному слою. Секреторный Eb – это высокая призматическая клетка (высота – 70–90 мкм, диаметр – 5мкм) с развитым комплексом Гольджи и гранулярной ЭПС, цистерны которой ориентированы вдоль оси клетки. В апикальной части образуется отросток Томса треугольной формы, предназначенный для экзоцитоза секреторных пузырьков.
Образование эмали включает в себя 2 основные стадии: секреторную и созревания. Исходный матрикс эмали состоит из 60–70% воды, 20–30% белков и 15–20% минеральных ионов. Такая эмаль представляет собой гелеобразную ткань, не способную выполнять свои функции. Белковая матрица эмали представлена 3 основными белками: энамелином, амелогенином и амелобластином, среди которых амелогенин составляет более 90% от общего объема. Другие белки включают протеазы: матриксная металопротеиназа 20 (MMP20) и калликреин 4 (KLK4), которые облегчают посттрансляционный процессинг белков матрикса эмали, способствуют зарождению кристаллов гидроксиаппатита, их росту вдоль оси Eb и контролируют расстояние между кристаллами. Недавно этот список был дополнен амелотином и одонтогенным белком. В стадии созревания Eb укорачиваются (становятся 40 мкм в высоту), теряют отросток Томса, органеллы, участвующие в процессах секреции, подвергаются аутофагии. При этом 25% Eb погибают путем апоптоза и фагоцитируются. Функция Eb в стадии созревания – транспорт ионов, обеспечение кислотно-щелочного баланса, абсорбция органических веществ и воды. Завершение процесса минерализации приводит к тому, что в зрелой эмали содержится 1% органических веществ, а оставшиеся 99% объема занимает неорганический материал, в основном апатиты [1]. На стадии созревания обнаруживаются Eb 2-х типов. У Eb 1-го типа на апикальной поверхности образуется исчерченный край (RA). Установлено, что эти клетки участвуют преимущественно в активном транспорте неорганических ионов, которые переносятся через их цитоплазму и выделяются на апикальной поверхности. Они обладают высокой концентрацией Ca-связывающих белков. У Eb 2-го типа, на апикальной поверхности образуется гладкий край (SA). Эти клетки осуществляют резорбцию органических веществ и воды из первичной эмали. После завершения созревания эмали Eb вместе с клетками промежуточного слоя и звездчатым ретикулюмом образуют редуцированный зубной эпителий (вторичную кутикулу эмали), т.о. зрелая эмаль становится бесклеточной [3, 4].
Классические подходы тканевой инженерии эмали основываются на копировании биологии энамелогенеза в лабораторных условиях и включают в себя взаимодействие тканеспецифических стволовых клеток (SC), соответствующих скаффолдов и сигнальных молекул, инициирующих дифференцировку клеток и образование ткани de novo. Поскольку Eb, синтезирующие эмаль, утрачиваются после прорезывания, проводится активный поиск альтернативных источников для регенерации. В настоящее время тщательному изучению подвергаются неэнамеобластные компоненты ЭО, которые традиционно рассматривались как вспомогательные клетки, обеспечивающие форму зуба, транспортировку минералов для секреции эмали и безопасное прорезывание. В серии исследований по маркировке клеток и отслеживанию путей их дифференцировки выявлено, что маркер стволовости эпителиальных клеток Р63 определяется в клетках промежуточного слоя, звездчатом ретикулюме, базальных клетках орального эпителия. Клетки промежуточного слоя богаты щелочной фосфатазой и неорганическими фосфатами и связаны с Eb многочисленными десмосомами и нексусами, что объясняет их функцию как транспорт фосфатов и стабилизация ЭО. Однако щелочная фосфатаза является также маркером SC. Предполагается, что Р63 поддерживает стволовость эпителия посредством передачи сигналов Sonic Hedgehog (SHH), WNT и Notch. Кроме того, отмечено перемещение клеток внутри ЭО от звездчатого ретикулюма к промежуточному слою и затем слою Eb, что позволяет рассматривать их как резервуар SC. На стадии прорезывания пролиферирующие клетки выявлены также в апикальном сосочке и в области бифуркации корней. После прорезывания зуба Р63 обнаружен в клетках Гертвиговского эпителиального корневого влагалища (HERS), которое является продолжением наружного эпителия ЭО. В свою очередь, наружный эпителий, являясь источником постоянного замещения зубов у рептилий, рассматривается в качестве морфогенетической эпителиальной ткани с наивысшим регенераторным потенциалом [2].
Известно, что клетки первичного ЭО, выращенные на слоях питательных клеток, экспрессируют амелогенин, амелобластин, ММР 20, KLK4 и другие белки, связанные с эмалью [1]. Создано несколько клеточных линий, происходящих из ЭО. Среди них клетки-предшественники Eb мыши (ALC-ameloblast lineage cell line), которые были выращены на коллагене I типа и требуют добавления в среду эпителиального фактора роста (EGF). Отмечена способность клеток этого вида экспрессировать амелогенин и туфтелин (кислый белок эмали, обеспечивающий ее минерализацию), что говорит об их сходстве с Eb. Клеточная линия HAT-7 была получена из апикального конца резцов 6-дневных крыс и культивирована на коллагеновой губке в присутствии клеток-предшественников цементобластов (для создания эпителиально-мезенхимальной индукции). Клетки HAT-7 экспрессировали повышенный уровень амеогенина и амелобластина. Третья линия LS8 является самой старой, она была создана более 30 лет назад для изучения процессов развития эмали. Клетки этой линии также экспрессируют высокие уровни амелогенина, амелобластина, энамелина, ММР 20 [1, 5]. Однако ни одна из этих линий не образует эмалеподобные структуры, поскольку иммортализация связана со значительной степенью дедифференцировки клеток, препятствуя Э-б поддерживать уровень зрелости, необходимый для секреции амелогенинов и других белков эмали. В результате были исследованы другие источники SC Eb, включая клетки эпителиальных островков Малассе (ERM), эпителиальные клетки десен, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) и SC кератиноцитов человека (hKSC) [6]. Доказано, что первично культивируемые клетки HERS и ERM обладают примитивной популяцией SC. Так, клетки ERM способны к дифференцировке в костные, жировые и хрящевые клетки in vitro, они образуют кости, цементоподобные структуры и Шарпеевские волокна. При этом ERM, выращенные ex vivo, экспрессируют как маркеры мезенхимальных СК (СД 44, СД29, 90в), так и маркеры эпителиальных предшественников (цитокератин-8, Е-кадгерин, белок эпителиальной мембраны -1). Линия ERM была успешно получена из пародонта человека, зубов мудрости и здоровых премоляров. При совместном культивировании клеток ERM с клетками пульпы они дифференцируются в энамелоподобные клетки и проявляют минерализационную активность [7]. Для биоинженерии зачатка зуба из неэмбриональных источников предложено использовать эпителиальные клетки десен человека. После ферментативного расщепления и культивирования их ассоциировали с мезенхимой эмбриональных зубов мышей, после чего трансплантировали в почечные капсулы взрослых мышей. Через 6 недель из зубных зачатков сформировались зубоподобные структуры. При этом в коронковой части наблюдалась минерализация более высокой плотности, что соответствовало эмали. В то же время минерализация более низкой плотности, соответствующая дентину, занимала как коронковую часть, так и область корня и формировала камеру пульпы. При гистологическом исследовании в области эмали обнаружены эпителиальные клетки кубической формы, напоминающие Eb стадии созревания, а в области цемента обнаружены ERM [8]. Изучается возможность использования в биоинженерии iPSC, поскольку они обладают неограниченными способностями к экспансии и могут обеспечить необходимое для регенерации количество SC. В эксперименте показано, что совместное культивирование iPSC мыши с эпителиальными клетками привело к образованию клеток с эпителиально-подобной морфологией, которые экспрессировали маркеры эпителиальных клеток, p63 и цитокератин-14, а также маркеры Eb (амелобластин и эмелин). Эпителиальные пласты, полученные из iPSC человека, способны дифференцироваться в структуры зубов при совместном культивировании с мезенхимой зубов мышей. Их имплантация приводит к образованию зубоподобных структур, содержащих пульпу, дентин и эмалевое пространство. Анализ химического состава и физических свойств образовавшихся зубных структур показал, что они похожи на постоянные человеческие зубы. Оценка экспрессии специфических антигенов человека показала, что только эпителиальные компоненты зуба возникли из имплантированных дифференцированных iPSC, тогда как пульпа зуба и окружающие костеподобные структуры произошли от мезенхимальных клеток зубов мышей, а не от iPSC. Эти результаты показывают, что эпителиальные клетки дают начало эмаль-образующим Eb, в то время как мезенхимальные SC образуют дентинобласты и пульпу зуба [9].
Аналогичным образом на трехмерном каркасе из агарозы культивировали SC кератиноцитов человека в сочетании с зубной мезенхимой эмбриона мыши, SHH и фактором роста фибробастов-8 (FGF-8). Транспантированные в почечные капсулы мышей, они оказались способны к Eb дифференцировке и образованию эмали [10]. Высказывается предположение, что в эпителиально-мезенхимальных взаимодействиях помимо SHH и FGF-8 участвуют другие сигнальные молекулы, включая wingless (Wnt), костный морфогенетический белок (BMP), трансформирующий фактор роста β (TGF-β). BMP и FGF в нише эпителиальных SC в резцах мышей регулируют отложение эмали. Мезенхимальные сигналы, участвующие в индукции Eb, включают TGF-β1, BMP-4 и BMP-2, при этом передача сигналов BMP является решающей для дифференцировки Eb и образования эмали. Передача сигналов SHH сохраняет нишу SC, присутствующую в клетках шеечной петли моляров. Кроме того, SHH в клетках промежуточного слоя ЭО поддерживает дифференцировку и созревание Eb. Eb также экспрессируют факторы транскрипции, такие как Msx2 и Sp6, которые играют важную роль в энамелогенезе. Использование этих молекул может помочь генерировать предшественники Eb, инициировать их дифференцировку и синтез эмали [6].
Заключение. Прогресс биоинженерии эмали ограничен из-за высокого уровня специализации и чрезвычайно сложного эпителиально- мезенхимального взаимодействия клеток, участвующих в энамелогенезе. Для воспроизведения процессов развития эмали используются различные типы эпителиальных предшественников, идентифицируются сложные сигнальные каскады, регулирующие клеточную дифференцировку, разрабатываются соответствующие скаффолды и оптимальные условия культивирования клеток. Получение биоинженерных имплантов с эмалеподобной тканью в области коронки является уникальной задачей регенеративной стоматологии.