Сетевое издание

Международный студенческий научный вестник

ISSN 2409-529X

В настоящее время в Российской Федерации, как и в большинстве стран, сложилась неблагоприятная эпидемиологическая ситуация по парентеральному вирусному гепатиту. С 2001 года в нашей стране наблюдается тенденция к снижению заболеваемости острым гепатитом С (ОГС) [4]. После 2004 года выявление людей с хроническим гепатитом С (ХГС) стало снижаться. Однако до 2006 года наблюдалось увеличение числа больных ХГС среди детей. По данным специалистов, 1,4 - 2,4% граждан РФ заражены вирусом гепатита С (ВГС), при этом большинство этих людей уже имеют хроническую форму инфекции. ХГС характеризуется прогрессирующим течением, приводящим к циррозу печени (до 30%), первичной гепатоклеточной карциноме (до 15%) и экстракорпоральным проявлениям (до 74%) [9]. Вирус гепатита С - уникальный патоген, который может уйти от иммунного контроля, создавая новые генетические и антигенные варианты, задерживая образование Т-хелперного и Т-киллерного ответа при остром гепатите С и вызывать повторную инфекцию у выздоровевших людей. Интенсивное изучение инфекции HCV началось после идентификации её возбудителя в 1989 году и в первую очередь преследовало главную цель - создание профилактической вакцины [3, 5].

ВГС - вирусное заболевание, которое чаще всего возникает в виде посттрансфузионного гепатита с преобладанием безжелтушной и легких форм и склонно к хроническому протеканию процесса [7, 8]. Возбудитель - ВГС, содержит РНК. Геном HCV представлен одноцепочечной положительно заряженная РНК, которая кодирует 3 структурных (нуклеокапсидный белок core и нуклеопротеиды оболочки E1 - E2) и 5 неструктурных (NS₁, NS₂, NS₃, NS₄, NS₅) белков. Антитела (АТ), обнаруженные в крови пациентов с ВГС, синтезируют к каждому из этих белков.

Отличительной особенностью ВГС является волнообразное течение заболевания, при котором выделяют три фазы: острую, латентную и фазу реактивации. Острая фаза характеризуется повышенной активностью печеночных ферментов в сыворотке крови, содержащей классы AT IgM и IgG (к нуклеокапсидному белку core) к HCV с ростом титров, а также РНК HCV. Латентная фаза характеризуется отсутствием клинических проявлений, наличием в крови АТ класса IgG (к нуклеокапсидному белку core и неструктурным белкам NS₁ - NS₅) к HCV в высоких титрах, отсутствии AT класса IgM и РНК HCV или их присутствии в низких концентрациях на фоне небольшого увеличения активности печеночных ферментов в периоды обострения. Фаза реактивации характеризуется появлением клинических признаков, повышенной активностью печеночных ферментов, наличием AT класса IgG (к нуклеотидному белку core и неструктурным белкам NS) в высоких титрах, наличием HCV РНК и ростом титров AT класса IgM до HCV в динамике [6, 9].

AT к HCV в сыворотке крови в норме отсутствует. Диагноз ВГС на основан выявлении суммарных АТ  к HCV методом ИФА, которые появляются в первые 2 недели заболевания и указывают на возможное заражение вирусом или перенесенной инфекцией. Анти-HCV AT может сохраняться в крови реконвалесцентов в течение 8 - 10 лет с постепенным снижением их концентрации. Обнаружить АТ можно более года и более после заражения [1, 2]. При хронической ВГС АТ определяют постоянно и в более высоких титрах. Большинство тест-систем, используемых в настоящее время для диагностики ВГС, основаны на определении AT класса IgM, что позволяет верифицировать активную инфекцию. АТ класса IgM можно обнаружить не только при ОГС, но и при ХГС. Снижение их числа во время лечения пациентов ХГС может свидетельствовать об эффективной лекарственной терапии. В острой фазе инфекции отношение AT IgM\IgG составляет от 3 до 4 (преобладание AT IgM указывает на высокую активность процесса). По мере выздоровления это соотношение уменьшается в 1,5-2 раз, что указывает на минимальную репликационную активность [9].

Выявление суммарных AT  IgG к HCV методом ИФА недостаточно для диагностики ВГС, необходимо подтвердить их наличие методом иммуноблоттинга, чтобы исключить ложноположительный результат исследования. Пациента исследуют на наличие IgG класса AT к различным белкам HCV и IgM класса AT к HCV в динамике. Результаты серологического исследования вместе с клинико-эпидемиологическими данными позволяют установить диагноз и стадию заболевания, что играет важную роль для правильного выбора метода лечения. В основе ИФА лежит иммунная реакция взаимодействия антиген с антителом. Для обнаружения образовавшихся иммунных комплексов используют фермент, который предварительно метется узнающий компонент (антиген или антитело). Сам фермент визуализируют с использованием хромогенного медиатора, продуцирующего цвет. Превращение бесцветного хромогена в окрашенное вещество хромофор, который несет цвет, происходит под действием фермента, для которого хромоген является субстратом [2].

Цель исследования: сравнить результаты определения антител к вирусу гепатита С в сыворотке крови методом ИФА двух тест-систем.

Материалы и методы.

Для достижения поставленной цели было проведено скрининговое обследование  7814 человек на обнаружение анти-HCV АТ методом ИФА. Было обследовано 2266 мужчин, что составило 29% и 5548 женщин (71%), дети в возрасте до 15 лет составили ,4% (267 человек). Иммуноферментный анализ проводит в несколько этапов:

1) проведение иммунной реакции: получение иммунохимического комплекса в результате поэтапного или одномоментного добавления иммунных реагентов, один из которых содержит ферментную резку;

2) промывка твердой фазы, целью которой является удаление не связавшихся компонентов;

3) проведение ферментативной реакции, начинающейся после добавления раствора субстрата и хромогена с последующим внесением стоп-реагента для остановки реакции;

4) учет результатов анализа;

5) оценка результатов анализа.

Регистрация результатов иммуноферментного анализа заключается в оценке степени окрашивания основной части индикаторной полоски, измерении оптической плотности окрашенных растворов или интенсивности флуоресценции и хемилюминесценции. При исследовании, для выявления в сыворотках крови антител к ВГС (IgG и IgМ) применялись 2 тест — системы:  

• «Бест-анти ВГС (комплект 1/стрип)»
• Monolisa “Anti — НСV PLUS Version 2

Для сравнительного анализа двух тест — систем было поставлено параллельно 57 тестов исследования уровня антител к ВГС методом ИФА наборами «Бест — анти ВГС» и Monolisa «Anti — НСV PLUS Version 2». Полученные результаты подверглись статистической обработке определения экстенсивных показателей с помощью программы Microsoft Excel 2010.

Результаты исследования и их обсуждения.

Тест — системы представляют собой набор реагентов, основой которых являются рекомбинантные антигены ВГС, соответствующие участкам белков, кодируемых структурной (соге) и неструктурной (NS) областью генома ВГС, иммобилизированные на поверхности лунок полистироловых планшетов. Основным свойством набора является способность выявлять в сыворотках крови человека антитела к ВГС (IgG b IgМ) за счет их взаимодействия с рекомбинантными антигенами, иммобилизированными на поверхности лунок планшета. Образование комплекса антиген — антитело вызывают с помощью иммуноферментного конъюгата.

Полученные результаты обследования 7814 человек установили, что антитела к вирусу гепатиту С были обнаружены в 7 % случаев (537 человек). Из 537 человек анти — НСV АТ были обнаружены у 213 мужчин, что составило 40 % и у 324 женщин, что составляет 60%. При сопоставлении исследуемых по полу результаты исследований показали, что у обследованных женщин (6%) 1,5 раза реже, чем у мужчин (10%) обнаруживаются анти — НСV АТ (Рисунок 1).

Рисунок 1. Выявляемость положительных результатов при ВГС – скрининге в зависимости от пола

Положительная реакция на антитела подтверждалась тест-системой «Бест анти-ВГС» (набор реагентов для подтверждения наличия иммуноглобулинов классов G и М к вирусу гепатита С). Данный набор предполагает дифференцированное определение антител к структурным (соте) и неструктурным (NS _3-5) белкам вирусной частицы.

Одновременное присутствие соге и NS белков в крови наблюдалось у 76,5% мужчин и у 66 % женщин. В то же время антитела только к ядерным белкам были обнаружены у 15% женщин и у 8% мужчин. Только NS антитела выявлены у 12% женщин и 6% мужчин. Из 537 положительных исследований наличие антител к вирусу гепатита С было подтверждено у 495 пациентов. В 42 (22 женщины и 20 мужчин) случаях наблюдалась ложноположительная реакция, которая не была подтверждена в подтвердающем тесте.

В 57 образцах сыворотки крови определение антител было выполнено параллельно в двух тест-системах: «Бест — анти ВГС» и Monolisa “Anti — НСV PLUS Version 2. При проведении сравнительно скрининга двух систем были получены следующие результаты. В обоих тест-системах в 72 % случаях, в 41 из 57 образцов – реакция на антитела положительная. В подтверждающем тесте наличие антител подтверждено. В 16 тестах, что составило 28 %, было установлено несоответствие результатов исследования уровня антител к ВГС наборами «Бест — анти ВГС» и Monolisa “Anti — НСV PLUS Version 2.

 При анализе несоответствующих результатов было установлено: в 14 тестах (87%) набор Monolisa “Anti — НСV PLUS Version 2 дал отрицательный результат, набор «Бест — анти ВГС» - положительный. В подтверждающей тест-системе в этих образцах сывороток крови присутствовал только нуклеокапсидный белок соге или только неструктурные белки NS₃ - NS₅; и только в одном образце были обнаружены оба вида антител.

В 2 образцах сыворотки набор Monolisa “Anti — НСV PLUS Version 2” дал положительный результат на антитела к ВГС, при отрицательном результате в подтверждающей тест-системе (нуклеокапсидный белок соге и неструктурные белки NS₃ - NS₅ не обнаружены).

Таблица № 1

Заключение

Таким образом, было установлено, что АТ к вирусу гепатита С обнаружены в 7 % случаев (у 537 из 7 814 пациентов). Анти — НСV АТ были обнаружены у 213 мужчин, что составило 10% и у 324 женщин, что составляет 6%. В 495 случаях наличие антител было подтверждено при помощи специального набора реагентов для подтверждения наличия иммуноглобулинов классов IgG и IgМ к вирусу гепатита С. Ложноположительная реакция наблюдалась у 42 пациентов. Алгоритм диагностики гепатита С должен строго соблюдаться, в соответствии с СП 3.1.3112 — 13 «Профилактика вирусного гетита С» [10]. Наличие антител к вирусу гепатита С должно быть подтверждено с помощью специального подтверждающего диагностического набора. Параллельное исследование сывороток крови в двух диагностических тест-системах «Бест — анти ВГС (комплект 1/ стрип)» и Monolisa “Anti — НСV PLUS Version 2” показало, что в 28 % случаев, набор Monolisa “Anti — НСV PLUS Version 2” дал отрицательный результат, набор «Бест — анти ВГС» - положительный. В подтверждающей тест-системе в большинстве образцов крови присутствовал только нуклеокапсидный белок соге или только неструктурные белки NS₃ - NS₅ т. е. систематическое использование данной тест-системы для диагностики гепатита С может привести к снижению выявления антител к вирусу.