Создание моделей ИПСК для лечения нейродегенеративных заболеваний.
Существует множество подходов к созданию стволовых клеток для исследования заболеваний мозга. В этом обзоре мы обсудим индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК). Способность генерировать плюрипотентные стволовые клетки из взрослых полностью дифференцированных клеток, таких как фибробласты кожи, была крупным достижением в медицине в последние годы. Истинная плюрипотентность ИПСК была продемонстрирована успешным производством жизнеспособных мышей из ИПСК с использованием тетраплоидной комплементации. Озабоченность сохранением векторов перепрограммирования в хромосомной ДНК была смягчена разработкой методов перепрограммирования без интеграции вирусных векторов. Демонстрация того, что ИПСК могут быть получены от пациентов, открыла эру изучения фенотипов клеточных заболеваний в моделях клеток, полученных пациентами. ИПСК могут быть получены от пациентов пожилого возраста, что указывает на их полезность для таких поздних заболеваний, как нейродегенеративные заболевания. ИПСК, полученные от донора, несущего мутацию в гене риска заболевания, могут быть генетически скорректированы с использованием гомологичной рекомбинации, ZFN, TALEN или CRISPR / Cas9. Полученные в результате изогенные клетки могут использоваться в качестве нормального контроля или, возможно, для терапии трансплантации клеток. Эти методы могут также использоваться для введения мутаций, связанных с болезнью, в геномы здоровых донорских ИПСК. Генетически модифицированные клетки и родительские ИПСК могут быть дифференцированы в нейронные стволовые клетки (предшественников) (НСК). НСК могут быть размножены, отсортированы для соответствующих нейронных предшественников и дополнительно дифференцированы в зрелые специфические к ней неврологические подтипы. Для исследования нервных дегенеративных расстройств стрессоры клеток или старение искусственных клеток могут применяться для усиления фенотипов, специфичных для болезни. Клетки могут использоваться для скрининга соединений для обнаружения лекарств и тестирования новых терапевтических средств. Плюрипотентные стволовые клетки человека также могут быть дифференцированы in vitro в предшественники астроглиальных и олигоденроцитов, способные к дальнейшей дифференциации в зрелые астроциты и олигодендроциты in vivo. Возможности изучения генетических нейродегенеративных заболеваний также значительно улучшились современными методами редактирования генома. К ним относятся гомологичная рекомбинация и более современные и эффективные методы, включающие цинк-пальцевые нуклеазы (ZFN), транскрипционные активатор-подобные эффекторные нуклеазы (TALEN) и высокоэффективный и недорогой метод, называемый CRISPR. Система CRISPR / Cas9 состоит из CRISPR-ассоциированной нуклеазы Cas9 и короткой гидовой РНК (gRNA) для нацеливания на бактериальную двухнитевую ДНК-эндонуклеазу Cas9 на специфическую геномную последовательность. Подход CRISPR / Cas9 подвергся критике из-за побочных эффектов, однако дальнейшие достижения в технике поразительно уменьшили нецелевой мутагенез. Эти методы редактирования генома имеют много потенциальных применений для изучения нейродегенеративных заболеваний, включая коррекцию или генерацию генетических мутаций, а также добавление экспериментальных изменений в клеточные линии с генетическими мутациями, с приложениями для моделирования болезней или потенциально для подходов клеток. Одной из важных проблем моделирования нейродегенеративных патологий на современном этапе является несовершенство и отсутствие необходимых знаний о патогенезе этих заболеваний, а также наличие большого количества факторов риска такие как различные виды стрессоров (окислительный стресс, дефицит факторов роста, эксайтоксичность и другие), заболевания различных систем организма (заболевания сердечно-сосудистой системы, черепно-мозговые травмы), несоответсвующий образ жизни и т.д. ИПСК, полученные от пациентов с болезнью Хантингтона и амиотрофическим боковым склерозом, были успешно дифференцированы в зрелые нейроны с соответствующими свойствами и демонстрируют специфические для болезни фенотипы. Существует множество возможных применений технологии стволовых клеток для исследований нейродегенеративных заболеваний. К ним относятся изучение основных механизмов заболевания, идентификация терапевтических целей и разработка анализов для скрининга, так же могут быть разработаны клетки для трансплантации. Было проведено несколько обзоров применения ИПСК для изучения нейродегенеративных заболеваний. В этой статье мы сосредоточимся на последних достижениях в области ИПСК для понимания патогенеза и применения в терапии.
Болезнь Хантингтона (БХ). Болезнь Хантингтона – генетическое нейродегенеративное расстройство, вызванное умножением кодона CAG в гене HTT (Huntingtin). Нейроморфологическая картина представлена атрофией стриатума, а именно гибелью срединных шипиковых нейронов, а на поздней стадии и коры головного мозга. Уже существуют модели для дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток человека в фенотип, аналогичный срединным шипиковым нейронам. Национальный институт неврологических расстройств и инсульта, который является одним из институтов здравоохранения США, провел обширную серию исследования клеток, взятых от пациентов с увеличением триплетов CAG(cytosine-adenine-guanine) [1]. Эти ИПСК показали модели генной и белковой экспрессии, отличной от контрольной, в соответствии с функциями, которые изменены при болезни, такими как протеостаз, клеточный транспорт и метаболизм, а также метаболизм РНК. Кроме того, была замечена некая закономерность: клетки с большим количеством повторений триплета имели больше нарушений. После дифференцировки в нейронные линии были выявлены фенотипы, включающие изменения в клеточной адгезии и токсичности, метаболизме, и биоэлектрической активности, опосредованной ионными процессами в синапсах. Клетки с большим количеством увеличений CAG были наиболее уязвимы к изъятию из клеточных сред нейротрофического фактора мозга (BDNF), который стимулирует и поддерживает развитие нейронов. Другими стрессорами, вызванными увеличением триплета, были токсичность глутамата, окислительный стресс и ингибирование аутофагии. В другом исследовании была взята одна линия с увеличенным количеством повторов, но отличалась коррекцией мутации с использованием гомологичной рекомбинации. Для подтверждения плюрипотентности использовали анализ иммуноцитохимии, который показал экспрессию классических маркеров плюрипотентности: Nanog, Sox2, Oct4, SSEA4, и TRA-1-60. Основной целью было установить, приводит ли генетическая коррекция к изменению ранее установленных фенотипов БХ. Было показано, что коррекция сохраняется при дифференцировке ИПСК в нейроны in vitro и in vivo. Кроме того, исправление нормализовало активность каспазы, уровни BDNF, биоэнергетику митохондрий, сигнальные пути кадгерина и TGF-beta (Transforming growth factor beta), которые нарушены в генетически неисправленных клетках [2]. Так же были получены ИПСК БХ, у которых наблюдалась значительное увеличение лизосомальной активности, чрезмерная фрагментация митохондрий [3], повышенная активность репрессора транскрипции, блокирующий транскрипционный фактор REST (repressor element-1-silencing transcription factor). Исследователи обнаружили, что P110TAT(селективный ингибитор) тормозит фрагментацию митохондрий. Действительно, лечение им трансгенных мышей показало снижение митохондриальной дисфункции, моторного дефицита, невропатологии и смертности. Возможно, P110-TAT сможет предотвратить или замедлить прогрессирование БХ у человека. Вероятно, БХ влияет не только на нейроны, так как при дифференцировке ИПСК в астроциты появляются признаки клеточной патологии. ИПСК БХ были использованы для исследований в экспериментальной терапии. Используя анализ люциферазы, обнаружили изменение фенотипов в ИПСК БХ [4]. Соединение X5050 (производное энзоимидазола-5-карбоксамида) увеличивало экспрессию BDNF и нескольких других REST-регулируемых генов в префронтальной коре мышей с индуцированными хинолинатом стриатальными поражениями. Таким образом, описанные выше исследования показывают потенциал использования ИПСК БХ не только для изучения патогенеза, но и для тестирования в экспериментальной медицине. Так же открывается возможность трансплантации клеток в надежде на замену пораженным. Препараты нейронных предшественников были трансплантированы в крысиную модель БХ с эксайтоксическими стриатальными поражениями. Наблюдалось восстановление поведения, однако у транспланитрованных клеток развилась клеточная патология, что указывает на важность коррекции гена перед пересадкой [5].
Боковой амиотpофический склеpоз (БАС). Синдром бокового амиотрофического склероза является очень удобным для создания моделей с использованием ИПСК, так как существует ряд генетических мутаций, которые вызывают БАС, принадлежащий к группе фронтотемпоральных деменций (ФТД), а также выявлены случаи, вызванные неизвестными мутациями. Вдобавок, на современном этапе развития достаточно хорошо сформированы модели для создания двигательных нейронов, что делает допустимым изучение и последовательный анализ результатов исследований из разных лабораторий. Серия исследований показала, что заболевания, связанные с нарушениями фенотипа в клетках, были запрограммированы у пациентов с мутациями в TDP-43 (TAR DNA binding protein 43). Таким образом, моторные нейроны характеризовались повышенным уровнем мутантного белка TDP-43 в детергентной форме, вследствие чего выявлено повышение уязвимости к клеточным стрессорам, а также наличие цитозольных агрегатов в этих клетках в соответствии с более ранними сведениями в исследованиях клеток у пациентов с БАС [6]. Следовательно, подобные исследования согласуются с гипотезой о том, что мутации TDP-43 действуют через генетическое усиление функции, эффект которых может быть автономным в клетке. Исследования Наохиро Егавы, направленные на то, чтобы показать возможность применения специфических ИПСК для скрининга лекарств, выявили улучшение клеточного фенотипа [7]. В последующих, более обширных исследований были выбраны две-три линии ИПСК от пациентов с мутантым геном, и у здорового члена семьи, после чего была обнаружена повышенная чувствительность к стауроспорину, а также изменения уровня самого TDP-43 и микро-РНК (miR-9) [8]. Около 10% случаев этой болезни наследуются, и БАС-8 является аутосомно-доминантной формой семейного БАС, вызванная мутациями VAMP ассоциированным белком B/C (VAPB) [9]. Белок VAPB участвует во многих клеточных процессах и, вероятнее всего, способствует патогенезу других форм БАС, кроме БАС-8. Таким образом, фибробласты от пациентов с БАС-8 и от незатронутых болезнью членов семьи были перепрограммированы плюрипотентные клетки и дифференцированы до моторных нейронов, и по итогу было выявление понижение уровня белка VAPB. Придя к выводу можно предположить, что оптимальные уровни VAPB могут играть важную роль в механизме зарождения и развития БАС-8. Около 90% случаев БАС не относят к явной генетической наследуемости и характеризуются как спорадические. Из этой группы 20% случаев, связанные с генетическими мутациями, ассоциированы с Cu/Zn-супероксиддисмутазой SOD1 [10]. Выяснено, что этот фермент главным образом обезвреживает свободные радикалы, которые высвобождаются при метаболизме, а именно в митохондриях, при этом играя роль регулятора функций клетки. У животных, у которых были как активные, так и неактивные формы этого фермента проявляли симптомы, сходные с симптомами при БАС, такие как потеря контактов между синапсами моторных нейронов, нарушение митохондриальной активности и активация клеток глии. Опыт на мышах, при котором им вводили мутантный ген SOD1 позволил воспроизвести ключевые симптомы процесса нейродегенерации при БАС. Также этот опыт отразил то, что токсический эффект SOD1 не нарушает ферментативную активность. Тем не менее токсическое действие этого гена на данный момент рассматривается, как основная этимология БАС. Эти опыты позволили получить ИПСК для пациентов с семейной формой SOD1-ассоциированного с БАС посредством перепрограммирования первичных фибробластов, которые обладали свойствами эмбриональных стволовых клеток, в том числе неограниченной пролиферативной активностью и способностью к дифференцировке во все типы клеток организма, с помощью эктопической экспрессии генов четырех транскрипционных факторов Oct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4. Полученные линии ИПСК были детально изучены и охарактеризованы, а также были подробно разработаны методики их дифференцировки в моторные нейроны.
Заключение. Таким образом, в данной статье были проанализированы концепции создания моделей для нейродегенеративных заболеваний с помощью ИПСК. Основополагающим для успешного создания модели является выбор контрольных клеток для выявления патологических нарушений. В качестве контрольных клеток обычно используются эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), взятые из внутренней клеточной массы бластоцисты спустя 5-6 дней после оплодотворения, или ИПСК от здоровых доноров, не имеющих мутаций в гене риска заболевания, либо генетически исправленные клетки от самого пациента. Затем клетки выращивают в культуре, дифференцировка должна проходить с соответствующими нейронными предшественниками. Важным является последующая трансплантация выращенных клеток в мозг, а так же нужно, чтобы клетки не образовывали опухоли и не вызывали иммунную реакцию. После введения нейроны должны образовывать функциональные связи – синапсы. Это представляет собой сложный, но теоритически достижимый комплекс мероприятий. Интересно, что между моделями разных заболеваний возникают общие черты, такие как нарушения клеточного метаболизма и окислительный стресс. Одной из немаловажных целей является созданием моделей с несколькими типами клеток. Другим подходом в клеточном моделировании может быть использование 3D культур in vitro и химерных моделей. Сравнение трансплантированных здоровых и пораженных клеток грызунам может помочь понять клеточные и молекулярные процессы, которые вызывают проявления болезни. В конце концов, независимо от того, возможно ли лечение с помощью пересадки ИПСК, модели заболеваний могут использоваться для идентификации новых терапевтических подходов к лечению, а также для скрининга или тестирования новых терапевтических препаратов.