Proteus mirabilis – повсеместно встречающийся в природе, в том числе в загрязненной органическими веществами воде, условно-патогенный гнилостный микроорганизм из семейства Enterobacteriaceae. Представляет собой грамотрицательную, не образующую спор и капсул, очень подвижную полиморфную палочку, хорошо растущую на различных субстратах и обладающую сильной протеолитической активностью. В санитарной микробиологии протей считают индикатором гнилостного загрязнения объектов окружающей среды. Протей может обладать вирулентностью в отношении ослабленных животных и людей.
Shewanella putrefaciens – грамотрицательная полиморфная бактерия, обитает в пресной, солоноватой и солёной водных средах, является факультативным анаэробом. Впервые Shewanella putrefaciens была выделена из молочных продуктов Derby и Hammer в 1931 году, в тот момент ей было присвоено название Achromobacter putrefaciens. Затем её именовали Pseudomonas putrefaciens. В 1981 году она была отнесена к виду Shewanella putrefaciens. Shewanella putrefaciens оказывает значительное влияние на водную флору и фауну. У инфицированных этим микроорганизмом морских животных возникают повреждения кожных покровов в виде гнойно-некротических очагов. Могут также поражаться мягкие ткани, брюшина, кровь. Обычно морские животные заражаются в условиях экологического стресса, и тогда все внутренние органы могут быть инфицированы, что наносит большой урон морскому промыслу. В результате способности бактерии производить летучие сульфиды, амины и дурнопахнущие соединения триметиламина, объекты морского промысла, обсеменённые шеванеллой, выделяют запах гниющих водорослей, интересно также, что Shewanella putrefaciens может вызывать коррозию на стальных поверхностях морских судов. Это происходит за счёт её способности производить сульфиды и разрушать структуру железа. Биологические свойства Shewanella putrefaciens как патогена, общего для человека и животных, изучены недостаточно.
Pseudomonas rhodesiae – бактерия, обитающая в пресной, солоноватой и солёной водных средах. Pseudomonas rhodesiae – микроорганизм из семейства Pseudomonadaceae. Представляет собой аэробные, психрофильные, грамотрицательные мелкие палочки, не образующие спор и капсул, располагающиеся в мазке беспорядочно, одиночно и попарно. Pseudomonas rhodesiae проявляет замедленный и скудный рост на различных питательных средах для энтеробактерий и псевдомонад. Потенциальная вирулентность изучена недостаточно.
Объектом нашего изучения были культуры Shewanella putrefaciens, выделенные при исследовании мазка из гнойно-некротического очага на коже белухи, содержащейся в океанариуме Крыма.
Цель исследования:
1. Определение вирулентных свойств выделенных из патологического материала микроорганизмов – представителей водной среды обитания;
2. Поиск оптимальной биомодели для изучения вирулентности бактерий – возбудителей болезней животных, обитающих в воде.
Материалы и методы. Исследовали чистые культуры Proteus mirabilis, Shewanella putriphaciens и Pseudomonas rhodeziae, выделенные в виде ассоциации из гнойно-некротического очага на коже белухи. Перед изучением вирулентности делали их пересев на скошенный ГРМ-агар, культивировали в течение 24 часов при 37 градусах С, (а медленно растущую Pseudomonas rhodeziae – в течение 48 часов при 20 градусах С), производили смыв культур 0,9 %-м раствором хлорида натрия и доводили концентрацию полученной суспензии микробных клеток до 1 млрд КОЕ/мл по стандарту мутности.
Изучали влияние данных микроорганизмов при использовании следующих биомоделей:
• Взрослые белые мыши при заражении подкожно, в дозе 0,2 мл и внутрибрюшинно в дозе 0,5 мл.
• Куриные эмбрионы, возраст 7 суток, при заражении в желточный мешок, в дозе 0,2 мл.
Нами предложены для изучения водных микроорганизмов ещё две биомодели:
1. Взрослые рыбки гуппи, самки, при внесении 1 см3 взвеси смыва суточной культуры бактерий концентрацией 1 млрд КОЕ/мл на 2 л аквариумной воды.
2. Пресноводные аквариумные моллюски красные роговые катушки ( Planorbarius corneus) при внесении 1 см3 взвеси смыва суточной культуры бактерий концентрацией 1 млрд КОЕ/мл на 2 л аквариумной воды.
Наблюдение за биомоделями вели в течение 10 суток.
Результаты исследования. Установлено, что клинические изоляты Proteus mirabilis и Shewanella putrefaciens проявляют вирулентность при заражении белых мышей, куриных эмбрионов, рыбок гуппи и пресноводных аквариумных моллюсков роговых катушек ( Planorbarius corneus).
Наиболее вирулентной является культура Proteus mirabilis, вызывающая гибель 2 мышей из двух заражённых в течение 4 суток после введения материала. Эта же культура вызывает гибель куриного эмбриона при просмотре на 5-й день инкубации после заражения. При вскрытии наблюдалось интенсивное помутнение аллантоисной жидкости, разложение тканей эмбриона и неприятный запах тухлого мяса.
Шеванелла и псевдомонада родезия не вызывали гибели мышей при подкожном и внутрибрюшинном заражении.
Куриные эмбрионы при заражении шеванеллой погибали в течение недели после заражения в желточный мешок. При просмотре вскрытых куриного эмбрионов наблюдали кровоизлияния сосудов желточного мешка, серо-зелёный цвет содержимого желточного мешка, помутнение аллантоисной жидкости и неприятный резкий запах гниющих водорослей.
Однако биомодель – куриный эмбрион не является удобной при изучении вирулентных свойств микроорганизмов.
При внесении в аквариумную воду культуры Proteus mirabilis в течение 5 дней погибли обе рыбки гуппи. Перед гибелью у рыбок наблюдали кровоизлияния в сосудах хвоста и жабр. Это было хорошо видно невооружённым глазом. Вода сильно помутнела.
Все моллюски-катушки в воде, заражённой Proteus mirabilis, погибли в течение 1 суток после внесения культуры. Мы наблюдали падение моллюсков на дно аквариума, прекращение движений, расслабление мускулатуры с выпадением части тела моллюска во внешнюю среду.
При заражении воды в аквариуме культурой Shewanella в течение 5 дней погибла 1 рыбка из двух. У второй рыбки наблюдалась заторможенность, нарушение координации движений, плавание под углом к поверхности воды головой вверх. Вода в аквариуме вначале сильно помутнела, однако потом – стала прозрачной.
В аквариуме после заражения культурой шеванелл погиб один моллюск-катушка из 3 при этом. Мы наблюдали, как и в случае, описанном выше, падение моллюска на дно, прекращение движений и частичное выпадение тела моллюска во внешнюю среду.
При заражении воды в аквариуме культурой Pseudomonas rhodeziae гибели рыбок и моллюсков не наблюдалось. Вода оставалась слегка мутноватой.
Установлено, что наиболее вирулентным возбудителем гнойно-некротического процесса на коже белухи явился Proteus mirabilis. Вирулентными свойствами слабой степени обладает также Shewanella putrifaciens. Изолят Pseudomonas rhodeziae авирулентен. По результатам исследования микроорганизмов – возбудителей болезней морских млекопитающих – предлагаем в качестве биомодели для определения их вирулентности использовать недорогую и удобную биосистему: пресноводный аквариумный моллюск – красная роговая катушка (Planorbarius corneus).