Активные формы кислорода (АФК) – это молекулы органического или неорганического происхождения, имеющие неспаренный электрон на внешнем электронном уровне. В большей степени к ним относятся ионы кислорода, свободные радикалы и различные перекисные соединения. Образование АФК в клетках бактерий происходит в аэробных условиях на клеточной мембране и связано это с деятельностью цепи дыхательных ферментов. Утечка электронов из электронно-транспортной цепи в процессе окислительного фосфорилирования и непосредственное их взаимодействие с кислородом – основной путь образования активных форм кислорода в большинстве клеток. Тем не менее, образование продуктов неполного восстановления кислорода считается нормальным процессом. Активные формы кислорода и радикалы, синтезируемые в организме, выполняют как вредные, так и полезные для клетки функций. Высокая концентрация свободных радикалов в клетке может привести к окислительному стрессу, вызывающему повреждение различных структур: ДНК, белков и липидов. У бактерий могут образовываться гидроксильные радикалы, которые в дальнейшем окажут повреждающее действие. Гидроксильные радикалы, воздействуя на гистидиновые группы и аминокислотные составляющие белков, вызывают их разрушение, и повреждают ферменты. Мутацией и гибелью бактерий может произойти из-за разрыва нуклеиновых кислот и углеводных мостиков. Негативное воздействие АФК на клетку может привести к клеточной смерти. Вследствие высокой токсичности АФК произошло существенное сокращение биоразнообразия первичной анаэробной микробиоты. Однако большинство видов бактерий выработало средство защиты от губительного действия активных форм кислорода – антиоксидантные системы. Под действием NO-синтаз в организме образуются токсичные продукты метаболизма оксида азота, которые носят название реактивные формы азота (РФА). Они оказывают аналогичное отрицательное воздействие на клетку, вызывая «нитрозирующий стресс» [1 – 6].
Одним из удобных инструментов исследования влияния внешних факторов на бактерии в целом является оценка биолюминесценции, благодаря тесной связи с метаболическими путями клетки позволяющей оценивать интегральную жизнеспособность клетки. Ферментативный процесс, в котором происходит потребление кислорода и выделение большого количества света носит название бактериальная биолюминесценция. Для генерации свечения важным условием является наличие кислорода, при отсутствии данная реакция не пройдет. Явление биолюминисценции связано с окислением длиноцепочечных альдегидов с помощью люциферазы, в результате которого происходит свечение. Функцией бактериальной люциферазы или флавинзависмой монооксигеназы является окисление субстрата с отсоединением у него протонов и электронов, и в дальнейшем с переносом их к последнему акцептору. Бактериальная биолюминесценция представляет собой окисление флавинмононуклеотида, который окисляется до длинноцепочечного алифатического альдегида или до жирной кислоты, и затем происходит излучение кванта света с длинной волны 495 [7, 8].
Методика определения уровня токсичности свободных радикалов кислорода и азота на рекомбинантные люминесцирующие штаммы включает в себя изучение интенсивности биолюминесценции бактерий при воздействии токсических веществ, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем. Люминесцентные бактерии оптимальным образом сочетают в себе различные типы чувствительных структур, ответственных за генерацию биоповреждения (клеточная мембрана, цепи метаболического обмена, генетический аппарат). Это обеспечивается тем, что люминесцентные бактерии содержат фермент люциферазу, осуществляющую эффективную трансформацию энергии химических связей жизненно важных метаболитов в световой сигнал на уровне, доступном для экспрессных и количественных измерений. Основой такого подхода является то, что уменьшение интенсивности биолюминесценции пропорционально токсическому эффекту. Острое токсическое действие исследуемой пробы на бактерии определяется по ингибированию их биолюминесценции за 30-минутный (в экспрессном варианте – 5 минут) период экспозиции [9 – 12].
Проведение подобного рода исследований с использованием ряда люминесцирующих бактерий, имеющих различное строение клеточных систем, позволит иметь представление об уровне токсичности АФК и РФА для данных микроорганизмов. Сопоставление полученных данных с бактерицидностью поможет разработать рекомендации для быстрого тестирования эффективности дезинфицирующих агентов по уровню изменения интенсивности биолюминесценции [9].