За последние несколько лет страусоводство набирает популярность во всем мире как новая отрасль сельскохозяйственной деятельности [2], так как от этих птиц можно получить диетическое мясо, ценные шкуры, перья и яйца [3, 4, 12, 22]. Нарастающий интерес к бескилевым птицам, особенно страусам и эму привел к увеличению спроса на информацию о них [5, 13, 23], а особенно их генетических аспектах [6, 11, 14, 17,18,19, 25, 26]. Эти исследования направлены на определение генетической структуры страусов, например, оценки генетической изменчивости и анализа взаимосвязи между особями, принадлежащими к данной популяции [28].
Данная статья освещает ряд исследований, посвященных генетическому анализу популяции страусов с использованием молекулярных методов [17]. Полученные результаты могут быть использованы для тестирования генетического разнообразия и идентификации новых микросателлитных последовательностей. Следующий этап исследований должен включать изучение генома страусов, поскольку в настоящее время в доступной литературе есть нехватка данных о генетических картах сцепления для любых бескилевых. Однако, предварительная генетическая карта страуса разработана Хуанг и др. [14]. Ученые проанализировали 104 полиморфных микросателлитных маркеров с использованием двух поколений страусов.
Основная цель данного исследования заключалась в определении полиморфизма отдельных микросателлитных маркеров, характерных для страусов, так как микросателлитный полиморфизм широко используется в исследованиях по картографии генома.
Материалы и методы. Экспериментальный материал состоял из перьев, собранных из 150 страусов страусиной фермы в Stypułów, на которой птиц содержат в условиях соответствующих рекомендациям ЕС, Комитета Европейской конвенции о защите животных, содержащихся на фермах (T-AP) - Проект «Рекомендации по бескилевые (страусы, эму и нанду)» [24].
ДНК страусов ученые выделяли из перьев (не инвазивным методом) с помощью DNeasy Tissue KIT 250 из Quiagen. Каждый образец был осмотрен с помощью спектрофотометра и электрофореза. Анализировали 30 микросателлитных последовательностей [25]. Характеристика локусов представлена в таблице 1.
Усиление выбранных микросателлитных последовательностей проводили с использованием термоциклера PTC-200 (MJ Research). ПЦР проводили в общем объеме 10 мл, содержащих 10 нг матричной ДНК, 0,5 мМ каждого нуклеотида, 100 нмоль каждого праймера, 1,5 мМ MgCl2, 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl, 0,01% Tryton Х 100 и 0,5 единицы ДНК-полимеразы (POLGEN). Условия ПЦР были оптимизированы для всех 30 пар праймеров. Протокол ПЦР ставили с шагом денатурации в течение 5 мин при 94 °С, 35 циклов при 94 °С в течение 45 с, 52,5-69,5 °С в течение 45 с (отжиг) и при 72 °С в течение 90 с (расширение), с конечной стадией элонгации 10 мин при 72 °С.
Флуоресцентные ПЦР-продукты разделяли с помощью электрофореза с использованием четырех капилляров генетического анализатора Applied Biosystems 3130 и программного обеспечения GeneScan. Результаты были визуализированы и генотипированы с использованием GeneScan 2.1. Кроме того, компьютерная программа GeneMapper (Applied Biosystems) была использована для автоматического определения размера аллеля для отдельных маркеров.
1. Характеристики 30 микросателлитных локусов страуса
|
Микросателлит |
Последовательность микросателлита |
Повторение мотива |
Количество аллелей |
Длина аллелей |
|
CAU1 |
TTACAAGCAAGGTAGAACCCA |
(AC)8AT(GC)3(AC)7 |
10 |
86-104 |
|
GCAAGCAACCCAATCCCTG |
||||
|
CAU3 |
AACTAAGTATAGCCCTGTTACA |
(CA)9 |
6 |
115-125 |
|
TGCGAGTCTTTCTAGTTCTAC |
||||
|
CAU7 |
CACTCCTGTCCCCTACTTG |
(AC)18 |
12 |
185-211 |
|
CTGTAGTGTATTTAGAGACTGA |
||||
|
CAU11 |
CCTTGACAGTCTTCCCATATGAC |
(CA)12 |
7 |
98-114 |
|
AACACAGAGGGCTTAGTCCTACA |
||||
|
CAU14 |
ATTTAACTTCTCTAAGGCACTC |
(CA)16 |
14 |
142-178 |
|
GAGGAGCAATTCAGACAGAC |
||||
|
CAU16 |
TGTCCCTGCAGTCTCAGTTTT |
(CA)27 |
7 |
188-204 |
|
GCCAGGTATGTGCATGTGTC |
||||
|
CAU17 |
CGTAAACCCAGATAATCACAA |
(CA)22 |
11 |
160-180 |
|
AGTGGCATTGTAGCTCTTCA |
||||
|
CAU22 |
TGACTGTTAAATAAGCGAATGT |
(AC)11 |
7 |
140-154 |
|
CATATATTAAGCCACTCTAAAAT |
||||
|
CAU23 |
AGGAACCGTGGAACACATTT |
(CA)10 |
7 |
165-193 |
|
GAGCTGTGAACGTCTTCATCC |
||||
|
CAU25 |
ATGGGGCAGCATAAGAGTGT |
(CA)5CT(CA)8 |
6 |
197-207 |
|
CCAGGTGAATTTGCCACATA |
||||
|
CAU30 |
AGGGGAGCGTTCTCACTCA |
(CA)19 |
9 |
117-137 |
|
GCCACAAAGCAAAAGACCAC |
||||
|
CAU32 |
ATACTGGTTTTGATTTGTGTGAT |
(CA)10 |
7 |
177-205 |
|
CATGGGAAGGGCAATAGATTT |
||||
|
CAU34 |
ATTTGATAGCCAGAGCAGTTC |
(CA)12 |
7 |
194-208 |
|
TCTTACAAGATTTCACTATATACA |
||||
|
CAU40 |
ACGGGGAGACTCAAGGATG |
(CA)9 |
9 |
138-156 |
|
GCTTGCGTGTGCATGAGTAT |
||||
|
CAU42 |
AGTCCAGCCCGCATACAC |
(CA)10 |
7 |
182-198 |
|
CCTCTGTGGAGAGAACTGTGTG |
||||
|
CAU43 |
ACTGAGTGCCCAGGTTTGAG |
(CA)17 |
6 |
211-221 |
|
TGCTGTTTCTTCTTCTTTTAGGG |
||||
|
CAU44 |
GCAAAGCAGTGTCCTTAGTCAA |
(CA)12 |
5 |
227-237 |
|
AGCGTGTATCTGCCACATGA |
||||
|
CAU57 |
AAGAGGCAACAGGAATAGGTA |
(CA)7(TA)5(CA)5 |
6 |
201-221 |
|
CAAAAATCTGGCTTGTCACTTA |
||||
|
CAU64 |
AGCACCTCATCCCTCAAAC |
(CATA)7(CA)6(TA)4 |
9 |
161-183 |
|
AGATTTGGAGCATGGACTATT |
(CA)15 |
|||
|
CAU65 |
TGAGAGTCTCCCAGAAATGC |
(TA)12(CA)9 |
6 |
181-191 |
|
CAGAGAAATATATGCCTGTAAAT |
||||
|
CAU68 |
TCTAAGCACTACCATCACGG |
(TA)7(CA)8...(CA)15 |
6 |
265-275 |
|
GCTCCTTTTCATCTTTTAGGC |
||||
|
CAU69 |
TGAGTAAGGCATGCTGCTTC |
(GA)19 |
6 |
100-112 |
|
CCTAAATGCAACCCTTCTGTTT |
||||
|
CAU75 |
ACAGACCAGGGAGTCCAGCA |
(GC)7(AC)18 |
7 |
186-210 |
|
ACCCTGCACCTTGACAACAT |
||||
|
CAU76 |
GCACCAATCTTGATGTCCTG |
(CA)11CG(CA)5 |
10 |
220-254 |
|
ACCTACCCAGAATGGCTTGA |
||||
|
CAU78 |
CAGGTGGAAAGTGGGTATGC |
(AC)8C5 |
5 |
113-121 |
|
GCTTTGTAAGTGTGGGTGTGG |
||||
|
CAU83 |
AAACAAGCCGCTAGTGAGGA |
(AC)16 |
8 |
198-218 |
|
TGCAGACTCAGACCAGCATC |
||||
|
CAU84 |
TATCAGTGCCATTATCGTCTC |
(CA)12 |
7 |
202-214 |
|
TGTCCCTTCTGTTTCTAATACT |
||||
|
CAU85 |
GAGGTGCCTGTCTTGTTTAC |
(AC)26 |
16 |
204-276 |
|
AAAAGCACCTTCCCACATTG |
||||
|
CAU97 |
TGCACGCACTAACTCCTGTC |
(CA)10 |
5 |
152-166 |
|
AGTTCCCCTTCCAAATGCTT |
||||
|
CAU98 |
CACTCCACCGAATGCCTTTA |
(CA)12 |
8 |
134-178 |
|
TTTGTTCAGGTGCAGAATGC |
Статистический анализ полученных результатов проводили с использованием программы Cervus [15]. Она включала в себя: определение частоты выявленных аллелей, оценивание наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности, индекс полиморфизма (PIC) и вероятность исключения случайного совпадения алеллей (PE).
Наблюдаемая гетерозиготность Hо была оценена для всех микросателлитных локусов рассматриваемой популяции. Ожидаемая гетерозиготность He была рассчитана по формуле Отта [20] и Уир [27], PIC оценивалась по Botstain и др. [1].
Результаты и обсуждение. В целом по 30 микросателлитным локусам было идентифицировано 343 аллели. Наиболее полиморфными были локусы: CAU84, CAU32, CAU7, CAU75 и CAU76, характеризирующиеся наибольшим количеством аллелей. Число алеллей на один локус колебалось от 5 по локусу CAU78 до 34 по локусу CAU85. По каждому микросателлитному локусу изучено в среднем 11,43 аллелей. Хотя другими учеными [17], анализировавшими 5 микросателлитных локусов был идентифицирован 51 аллель. Число аллелей в этих исследованиях на локус колебалось от 5 (локус ВИА-OS22) до 16 аллелей (локус VIAS-OS29). Среднее число аллелей на локус составляло 10,2.
Аналогичное исследование на выделения и характеристику 70 новых микросателлитных маркеров у страусов провели Тан и др. [25]. Число аллелей, полученных ими, колебалось от 2 до 16, в среднем 5,6 по локусу. Тем не менее, в исследованиях Уорд и др. [26], число аллелей по локусу колеблется от 5 до 18 и в Kimwele и др. [19] - от 6 до 25 аллелей.
На основании частоты отдельных аллелей исследуемых микросателлитных локусов оценили наблюдаемую гетерозиготность (Ho). Значения наблюдаемой гетерозиготности колебалась от 0,467 по локусу CAU78 до 0,993 по локусу CAU16 (табл. 2). Значения ожидаемой гетерозиготности (Hе) колебалось в диапазоне от 0,510 по локусу CAU78 до 0,953 по локусу CAU85. Следует отметить, что оба значения (Ho и Hе) в исследуемой популяции страусов были относительно высокими. По данным Kimwele и др. [19] значение средней гетерозиготности страусов, разводимых в Национальном парке Найроби, а также содержащихся на фермах в Кении, колеблется от 0,40 до 0,79. В свою очередь, Kawka др. [17], рассматривая генетическую изменчивость внутри и между тремя подвидами страусов, определили, что наблюдаемая гетерозиготность колеблется в пределах от 0,463 до 0,663, а ожидаемая - от 0,481 до 0,679.
Учеными также было исследовано генетическое разнообразие в популяциях эму, содержащихся на фермах в Австралии и Таиланде [10]. Всего было изучено 5 микросателлитных локусов. Следует отметить, что в обеих популяциях значение ожидаемой гетерозиготности колебалось в широких пределах. Для страусов, разводимых на фермах Австралии ожидаемая гетерозиготность составляла 0,44-1,0 в то время как для птицы, разводимой в Таиланде - 0,28-0,89.
2. Наблюдаемая (Ho) и ожидаемая (He) гетерозиготность страусов
|
Локус |
Ho |
He |
Локус |
Ho |
He |
|
CAU1 |
0,880 |
0,867 |
CAU43 |
0,913 |
0,836 |
|
CAU3 |
0,953 |
0,737 |
CAU44 |
0,860 |
0,688 |
|
CAU7 |
0,807 |
0,701 |
CAU57 |
0,713 |
0,832 |
|
CAU11 |
0,960 |
0,839 |
CAU64 |
0,893 |
0,876 |
|
CAU14 |
0,960 |
0,821 |
CAU65 |
0,700 |
0,820 |
|
CAU16 |
0,993 |
0,862 |
CAU68 |
0,780 |
0,850 |
|
CAU17 |
0,840 |
0,859 |
CAU69 |
0,967 |
0,840 |
|
CAU22 |
0,913 |
0,814 |
CAU75 |
0,867 |
0,869 |
|
CAU23 |
0,780 |
0,724 |
CAU76 |
0,873 |
0,853 |
|
CAU25 |
0,820 |
0,738 |
CAU78 |
0,467 |
0,510 |
|
CAU30 |
0,967 |
0,809 |
CAU83 |
0,833 |
0,781 |
|
CAU32 |
0,687 |
0,868 |
CAU84 |
0,833 |
0,841 |
|
CAU34 |
0,780 |
0,685 |
CAU85 |
0,953 |
0,939 |
|
CAU40 |
0,953 |
0,757 |
CAU97 |
0,853 |
0,754 |
|
CAU42 |
0,513 |
0,664 |
CAU98 |
0,900 |
0,722 |
|
В среднем |
0,840 |
0,791 |
|
|
|
|
SE |
0,023 |
0,018 |
|
|
|
Еще одним важным показателем, используемым для характеристики генетической изменчивости локуса, является индекс полиморфизма (PIC). Наибольшее значение для этого показателя, более 0,7, наблюдалось для локусов CAU85 (0,932), CAU64 (0,861) и CAU32, 75 (0,852) (табл. 3). Эти микросателлиты наиболее полиморфными и наиболее информативны при анализе генетических связей. Самые низкие значения (PIC=0,462) были характерны для локуса CAU78. Тогда как в предыдущем исследованиях, проведенных на страусах Kawka и др. [17], значение PIC располагалось в диапазоне от 0,117 до 0,786. Следует подчеркнуть, что почти все микросателлитные маркеры, выбранные для анализа были высокополиморфны или характеризовались высокими значениями индекса полиморфизма.
Среди наименее полиморфных микросателлитных маркеров можно отметить локус CAU78.
3. Индекс полиморфизма (PIC) и вероятность исключения случайного совпадения аллелей (PE) для микросателлитных локусов страусов
|
Локус |
PIC |
PE |
Локус |
PIC |
PE |
|
CAU1 |
0,850 |
0,888 |
CAU43 |
0,812 |
0,841 |
|
CAU3 |
0,692 |
0,689 |
CAU44 |
0,642 |
0,637 |
|
CAU7 |
0,677 |
0,730 |
CAU57 |
0,812 |
0,857 |
|
CAU11 |
0,819 |
0,860 |
CAU64 |
0,861 |
0,905 |
|
CAU14 |
0,794 |
0,820 |
CAU65 |
0,792 |
0,815 |
|
CAU16 |
0,845 |
0,889 |
CAU68 |
0,828 |
0,859 |
|
CAU17 |
0,840 |
0,877 |
CAU69 |
0,818 |
0,852 |
|
CAU22 |
0,785 |
0,808 |
CAU75 |
0,852 |
0,895 |
|
CAU23 |
0,704 |
0,763 |
CAU76 |
0,834 |
0,876 |
|
CAU25 |
0,690 |
0,677 |
CAU78 |
0,462 |
0,446 |
|
CAU30 |
0,781 |
0,808 |
CAU83 |
0,756 |
0,797 |
|
CAU32 |
0,852 |
0,897 |
CAU84 |
0,818 |
0,846 |
|
CAU34 |
0,643 |
0,656 |
CAU85 |
0,932 |
0,972 |
|
CAU40 |
0,718 |
0,731 |
CAU97 |
0,719 |
0,743 |
|
CAU42 |
0,646 |
0,710 |
CAU98 |
0,689 |
0,720 |
Также была подсчитана вероятность исключения случайного совпадения аллелей для каждого локуса (табл. 3). Значение PE находились в диапазоне от 0,446 в локусе CAU78 в 0,972 на локус CAU85. Тогда как Kawka и др. [17] проанализировали пять микросателлитных локусов и получили очень высокую вероятность исключения случайного совпадения аллелей от 0,77 до 0,98. Анализ 30 микросателлитных представленных локусов дает очень высокую вероятность исключения неправильного происхождения - от 0,77 до 0,98. Представленные результаты показывают, что анализ этих 30 микросателлитных локусов может быть успешно применен в идентификации происхождения страусов, разводимых в Польше.
В целом, микросателлитные маркеры, используемые в исследовании ученых, были очень полиморфны, о чем свидетельствует большое количество обнаруженных аллелей и высокий уровень гетерозиготности. Эти микросателлитные маркеры могут быть использованы для генетического картирования страусов а также построения сравнительных карт других бескилевых, таких как эму и нанду.