В современном мире в связи с удлинением жизни и улучшением ее качества проблема амилоидоза становится все более актуальной, поскольку увеличивается общее число больных, страдающих хроническими воспалительными заболеваниями, и людей с наследственными формами амилоидоза.
Установлено, что амилоидоз сердца обнаруживается у 2,3% умерших в возрасте до 50 лет, в возрастной группе 50-70 лет его выявляют у 30%, в группе 70-80 лет – уже у 41%, а у лиц, умерших в возрасте старше 90 лет, амилоидоз миокарда обнаруживали в 71-90% случаев [Козловская Л.В., Рамеев В.В., Саркисова И.А. Амилоидоз у пожилых // Клиническая медицина: научно-практический журнал. – 2005. – Т. 83, № 6. – С. 12-20. – ISSN 0023-2149].
В то же время, теории, удовлетворительно объясняющей все патогенетические феномены, свойственные различным формам амилоидогенеза и одновременно позволяющей прогнозировать эффективность средств лечения и профилактики этой патологии – нет.
Все известные нам способы получения экспериментального системного амилоидоза предполагают в качестве экспериментальных животных использование старых животных мышей, крыс или морских свинок, поскольку именно старческая брадитрофия тканей позволяет осуществить моделировании амилоидоза. На молодых крысах амилоидоз с использованием известных способов не воспроизводится вследствие особенностей обмена веществ. Однако использование старых животных не позволяет проводить долгосрочный фармакологический эксперимент по лечению и профилактике амилоидоза. Продолжительность пребывания старых животных в каком-либо эксперименте резко ограничена преклонным возрастом.
В связи с вышесказанным, целью нашего исследования является разработка собственных экспериментальных моделей амилоидоза, воспроизводимых на молодых животных.
Материал и методы
В эксперименте были использованы шестнадцать белых лабораторных половозрелых 35-дневных мышей-самцов массой 28,5±1,2 г, содержавшихся на стандартном рационе вивария. Случайным образом мыши были разделены на три группы по три мыши в первой и второй группах и четыре мыши в третьей группе:
1) контрольная группа,
2) группа, в течение 30-ти дней получали подкожно через день 0,5 мл смеси цельного молока, содержащей 30% сырого яичного альбумина, 15 инъекций,
3) группа, получали подкожно ежедневно в течение 30-ти дней яичный альбумин по 0,5 мл вместе со взвесью дигидрокверцетина в 3% растворе крахмального клейстера из расчета 1,5 мг/кг массы per os. Все мыши в течение всего времени эксперимента находились в одной клетке. Доступ к воде и корму был свободный.
По окончании введения белковых препаратов мыши были декапитированы. Органы: печень, левая почка, селезенка, – изъяты, измерены миллиметровой лентой, взвешены на электронных аналитических весах и зафиксированы 10% нейтральным формалином. После формалиновой фиксации органы были отмыты проточной водой, проведены через батарею спиртов восходящей крепости для обезвоживания и залиты парафином.
Из парафиновых заливок были приготовлены срезы толщиной 5 мкм, которые монтировали на предметных стеклах, после чего депарафинировали и окрашивали 1% раствором красного конго для выявления амилоида и докрашивали гематоксилином. Срезы микроскопировали в проходящем свете на микроскопе Лейка с последующей видеофиксацией микрофотографией в цифровом виде, а также на поляризационном микроскопе МИН-8.
Результаты исследования
Контрольная группа – форма, линейные размеры, цвет и консистенция органов интактных животных были в пределах возрастной нормы, каких-либо патологических изменений, вызванных болезнями лабораторных животных, не выявлено. Капсула почки снимается легко. Данные о влажной массе изъятых органов представлены в таблице.
На срезах почки диаметр клубочка составлял около 50-70 мкм. Нефротелий был представлен клетками, приближающимися к кубическому эпителию с округлыми ядрами и цитоплазмой, прокрашивающейся в кирпичный цвет. По количеству ядер в петлях капилляров клубочка определялось от 45 до 60 клеток и примерно столько же эритроцитов. Наблюдается картина нефрита. Канальцевый эпителий не имел морфологических отклонений и соответствовал гистологической норме. Отдельные сегменты клубочка представлены гомогенными конго-положительными депозитами, не содержащими ядер, которые сдавливали петли капилляров, о чем свидетельствуют ядра овальной или уплощенной формы. Выявлялись единичные эритроциты. Просветы канальцев несколько сужены, имели фестончатое строение, содержали зернистые массы. Цитоплазма канальцевого эпителия была мелкозернистая, со слабой конго-положительной реакцией.
Большая часть препаратов селезенки представлена белой пульпой, состоящей из лимфоидных фолликулов. Красная пульпа представлена ретикулярной стромой и эритроцитами. Морфологический паттерн соответствует гистологической норме.
Паренхима печени имела вид булыжной мостовой (вымывание гликогена в процессе подготовки срезов к окраске) – нормальная гистологическая картина. Цитоплазма клеток светооптически пустая, содержала мелкие зерна. Морфологический паттерн соответствует гистологической норме.
Вторая группа – визуально форма, линейные размеры и цвет печени животных этой группы не отличались от интактных, однако консистенция печени была более плотная, чем у интактных мышей, на срезе печень выглядела как сальная. Внешних различий формы, консистенции, цвета и линейных размеров почек в этой группе не наблюдалось. Капсула почки снимается легко. Селезенка была резко увеличена во всех размерах до 2,0±0,1 см в длину, 0,4±0,1 см в ширину и толщину в направлении от широкой части к селезеночной связке, в контроле 1,5±0,1×0,3±0,1×0,1±0,05 см, соответственно, консистенция плотная.
Лимфоидные фолликулы селезенки либо циркулярно окружены амилоидом, во многих фолликулах лимфоидная ткань замещена амилоидом с разной степенью выраженности. Красная пульпа практически отсутствует. Отмечается присутствие большого количества мегакариоцитов на разных стадиях формирования. Выявляются единичные указанные клетки с патологическим митозами, заключающимися в дехроматизации и рассеянии ядерного материала на два полюса клетки неравномерно (показано стрелкой).
Цитоплазма гепатоцитов при окраске конго красным мелко-вакуолизирована. Амилоид-положительное вещество выявлялось только в строме портальных трактов и стенках сосудов.
Таблица
Влажная масса изъятых органов, г
|
Орган |
1) группа, контрольная |
2) группа, взвесь 30% яичного альбумина в цельном молоке |
3) группа, взвесь 30% яичного альбумина с дигидро- кверцетином per os |
|
Печень |
4,14±0,1 |
5,2±0,1 р=0,002 |
5,4±0,1 р=0,002 |
|
Почка |
1,2±0,03 |
1,4±0,02 р=0,003 |
1,4±0,01 р=0,003 |
|
Селезенка |
0,8±0,015 |
2,1±0,04 р=0,000 |
2,0±0,034 р=0,000 |
Примечание: значения р приведены по отношению к интактной группе.
У мышей, получавших на фоне введения яичного альбумина дигидрокверцетин в дозе 1,5 мг/кг массы, морфологическая картина гистологических препаратов почки, печени и селезенки не отличалась от описанной выше модели с введением 30% взвеси яичного альбумина в цельном молоке. В связи с чем, полученные микрофотографии в данном отчете мы не приводим. Очевидно, что дигидрокверцетин в примененной дозе не повлиял на формирование амилоидной модели.
Таким образом, предлагаемые нами способы вызывают развитие системного амилоидоза у молодых мышей двухмесячного возраста. Данное обстоятельство позволяет проводить долгосрочный фармакологический эксперимент по лечению и профилактике амилоидоза.
Исходя из полученных результатов исследования можно сделать ряд выводов:
1. Разработанные нами модель амилоидоза хорошо воспроизводимы и может быть использована для экспериментального применения;
2. Использование дигидроквертицина не предотвращает развитие и отложение амилоида в паренхиматозных органах.