Введение

В настоящее время быстрое развитие технологий редактирования генома привело к крупным прорывам в области наук о жизни и медицины. В последние годы набор инструментов для редактирования генома на основе кластерных регулярно расположенных коротких палиндромных повторов (CRISPR) значительно расширился не только за счёт новых нуклеаз, ассоциированных с белком CRISPR (Cas), но и благодаря новым применениям в сочетании с различными эффекторами.

Существует большое количество генетико-эпидемиологических исследований в отношении заболеваний ССК, однако в данных работах в фокусе внимания исследователей находится анализ ассоциаций  SNP с униморбидными состояниями –  ИБС,  АГ, ДЛЕ или СД2. Отмечается значительный пробел в представлении генетической компоненты ССК [Tinoco Mesquita E. et al., 2016]. В данных работах выявлены «общие» гены предрасположенности и оценена принадлежность их белковых продуктов к биологическим процессам. Тем не менее, эти работы представляют собой мета-анализ результатов  GWAS по униморбидным состояниям болезней ССК. Кроме того, задача по оценке вклада CNV в формирование ИБС, особенно в коморбидном состоянии, включая ССК, остается нерешенной.

Цель исследования

Заболеваемость населения по болезни системы кровообращения по данным Росстат в 2023 году составляет 4530,4 на 100000 человек населения. Эта статистика подчеркивает острую необходимость в разработке новых и эффективных методов профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний, и CRISPR-Cas представляет собой многообещающий инструмент в этой области. Возможность точного изменения генома открывает путь к коррекции генетических мутаций, являющихся причиной моногенных заболеваний, а также позволяет создавать модели заболеваний для изучения их механизмов и тестирования новых терапевтических подходов. Особенно перспективным является применение CRISPR для изучения и лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Создание более точных моделей болезней сердца позволит лучше понимать их патогенез и разрабатывать новые, более эффективные терапевтические стратегии, включая методы генной терапии, направленные на коррекцию генетических дефектов, лежащих в основе этих заболеваний.

Нецелевая активность является серьёзной проблемой при использовании инструментов CRISPR для генной терапии заболеваний.На протяжении многих лет предпринимались постоянные попытки создать высокоточные варианты Cas9, в том числе eSpCas9, SpCas9-HF, HypaCas9, evoCas9, HiFi Cas9 и Sniper-Cas9. Недавно с помощью криоэлектронной микроскопии, ориентированной на кинетику, было показано, что несовпадения, расположенные дальше от PAM, могут быть стабилизированы петлёй в домене  RuvC, что позволяет активировать Cas9.Основываясь на этом наблюдении, они разработали высокоточный вариант с мутациями в домене RuvC под названием SuperFi-Cas9, который значительно улучшил распознавание несовпадений без ущерба для эффективности расщепления ДНК.

Для изучения генетических факторов, влияющих на ССЗ, используются различные геномные подходы:

1. GWAS (полногеномный поиск ассоциаций): выявляет SNP, ассоциированные с ССЗ, путем анализа геномов больших групп людей.

2. NGS (секвенирование нового поколения): позволяет масштабно секвенировать геномы, экзомы и транскриптомы для идентификации редких вариантов, мутаций de novo и изменений экспрессии генов.

3. WES (полноэкзомное секвенирование): экономически эффективно секвенирует кодирующие участки генов (экзом) для выявления генетических вариантов, влияющих на функцию белков.

4. Транскриптомика: анализирует уровни экспрессии генов для выявления ключевых генов и сигнальных путей в патогенезе ССЗ.

5. Метагеномика: изучает микробиом для выявления связей между его составом и риском ССЗ.

6. Эпигеномика: изучает эпигенетические модификации ДНК для выявления факторов, влияющих на экспрессию генов при ССЗ.

Материалы и методы исследования

Экспоненциальное развитие технологий редактирования генома кардинально изменило ландшафт биологических и медицинских исследований, возвестив о наступлении новой эры прецизионной медицины, основанной на редактировании генома. С помощью набора инструментов на основе CRISPR создание моделей заболеваний человека на животных стало намного проще, быстрее и гибче, чем когда-либо прежде. Эти модели значительно расширят наше понимание патогенеза сердечно-сосудистых заболеваний и помогут в разработке терапевтических стратегий. Кроме того, CRISPR-Cas позволяет не только создавать модели, но и проводить направленное редактирование генов в клетках и тканях, что открывает перспективы для разработки инновационных терапевтических стратегий. Это включает в себя коррекцию генетических дефектов, модуляцию экспрессии генов, влияющих на функцию сердечно-сосудистой системы, и разработку новых методов лечения аритмий, кардиомиопатий и других сердечных заболеваний. Системы CRISPR 1-го класса содержат несколько эффекторных молекул, которые обладают уникальными свойствами, такими как предпочтение определённых последовательностей PAM, более высокая специфичность в отношении целевого участка за счёт более длительного распознавания целевого участка и создание протяжённых геномных делеций. Однако перед их широким применением необходимо усовершенствовать требования к нескольким эффекторам и повысить относительно низкую эффективность редактирования.Постоянно предпринимаются усилия по выявлению новых ортологов Cas и созданию искусственных вариантов Cas для повышения эффективности редактирования генома и расширения совместимости. Поэтому активно ведутся поиски новых ортологов Cas и создание искусственных вариантов Cas для повышения эффективности, точности и расширения применимости CRISPR-систем. Улучшение CRISPR-систем критически важно для расширения их использования в разработке новых методов лечения, в том числе, сердечно-сосудистых заболеваний. Система CRISPR типа I класса 1 является наиболее распространенной системой CRISPR, в которой многокомпонентный CRISPR-ассоциированный комплекс для противовирусной защиты (Cascade) идентифицирует ДНК-мишени, а фермент Cas3, представляющий собой геликазную нуклеазу, расщепляет ДНК. Системы CRISPR типа I могут значительно расширить набор инструментов для редактирования генома благодаря своим уникальным механизмам и преимуществам при удалении полноразмерных генов, кластеров генов и некодирующих последовательностей. В отличие от систем II класса, системы CRISPR типа I предлагают уникальные возможности для редактирования генома, особенно в задачах удаления крупных участков ДНК, таких как целые гены, кластеры генов и некодирующие последовательности. Это открывает новые перспективы для изучения функций сложных генетических элементов и разработки терапевтических подходов, требующих удаления больших участков генома, например, при лечении некоторых сердечно-сосудистых заболеваний.

С учётом наличия представленных материалов и методов, совсем недавно было обнаружено, что системы CRISPR-Cas широко распространены в геномах различных бактериофагов, где они участвуют в конкуренции с другими вирусами. Белки Cas, кодируемые бактериофагами, содержат все известные типы систем CRISPR-Cas, но обладают специфическими для фагов свойствами.Эти белки Cas, такие как CasΦ и Casλ, как правило, имеют удивительно маленький размер из-за компактного вирусного генома.Было показано, что эти сверхкомпактные системы редактируют геномы клеток человека и растений, что указывает на то, что вирусные нуклеазы Cas могут служить новым источником инструментов для редактирования генома.

Компактность фаговых CRISPR-Cas систем может быть особенно полезной для доставки генетических инструментов в клетки сердца, что является сложной задачей в терапии сердечно-сосудистых заболеваний. Уменьшенный размер облегчает упаковку в вирусные векторы, используемые для доставки генов, и повышает эффективность проникновения в клетки, открывая новые возможности для генной терапии болезней сердца.

Компактность фаговых CRISPR-Ca явно связывает компактность с преимуществами для доставки в клетки сердца и подчеркивает актуальность для генной терапии болезней сердца.

Новые инструменты для изучения и модификации генома:

1. CRISPR-Cas9 для некодирующей ДНК: Помимо редактирования генов, кодирующих белки, CRISPR-Cas9 можно использовать для модификации регуляторных элементов, lncRNA и miRNA, что позволяет изучать их функции и разрабатывать новые терапевтические подходы.

2. Оптогенетика и хемогенетика: Эти методы позволяют контролировать экспрессию генов и активность белков с помощью света или химических соединений, что дает возможность изучать динамику генетических сетей в реальном времени.

3. Одноклеточное секвенирование: Этот метод позволяет анализировать геном, транскриптом и протеом отдельных клеток, что открывает новые перспективы для изучения клеточной гетерогенности и механизмов заболеваний.

Результаты исследования и их обсуждение

Пузырёвым В.П., Макеевой О.А., Голубенко М.В. были проведены исследования наследственной компоненты ремоделирования сердца включавшее анализ больных с эссенциально гипертоний; больных имеющих сочетание артериальной гипертонии и сахарного диабета 2-го типа и больных с моногенной формой гипертрофии миокарда – гипертрофической кардиомиопатией. Для анализы были выбраны 9 ключевых генов, регулирующих гипертрофический ответ миокарда на разных этапах, а именно: ACE; AGTR1; NOS3; TNF; GNB3; MYH7 и гены кальцинеуринового пути – GATA4 и PPP3CA. Результат привёл к тому, что большая часть исследованных генов, с которыми получены ассоциации, составляют группу синтропных генов. Механизм взаимосвязи может быть обусловлен координированной экспрессией этих генов, образующих единую генную сеть.
Следует заметить, что темп детекции генов, имеющих отношение к тем или иным болезням-синтропиям, может быть существенно увеличен с использованием современных технологий.

Также учёные пришли к заключению, что разные геномы воздействую на сердечно-сосудистую систему, нескольким из них я бы хотел уделить внимание:

• Ген-кандидат – Cyp11b1, 11 бета-гидроксилаз сам по себе дефицит его взывает гипертонию и, иногда, гипокалиемию, а именно отвечает за АД и массу левого желудочка.

• Игорь Сплавски представил современное описание мутаций и их функций в четырёх генах субъединиц калиевых каналов и одном гене сердечно-натриевого канала, все из которых вовлечены в резкое менделевское заболевание, синдром «удлиненного интервала QT» (состояние, связанное с повышенным риском внезапной сердечной смерти

• Субъединицы G-белка B-3 с артериальной гипертензией в афро-карибских популяциях. Функция гена: кодирует G-белок, участвующий в передаче клеточных сигналов (сигнальная трансдукция), в том числе при регулировке циркадных ритмов, кровяного давления и ответе клеток на гормон глюкагон

• Ген интерлейкина-1 с сосудистыми заболеваниями.
Функции ИЛ-1:
активация Т- и В-лимфоцитов; стимуляция стволовых клеток; ключевая роль в развитии местной воспалительной реакции через влияние на фагоцитирующие клетки и гранулоциты крови; взаимодействие с центральной нервной системой, вызывая лихорадку, летаргию, сон и анорексию.
Синтезируетсяпреимущественно макрофагами и моноцитами.
Сильное повышение уровня ИЛ-1приводит к гипотензии, анорексии, разрушению хрящей в суставах.

• Алистер Холл представил метаанализ исследований, изучающий связь полиморфизма вставки/ делеции сингиотензинпревращающего фермента (АПФ) с ишемической болезнью сердца.

• В развитие гипертрофии (увеличение клеток) миокарда вовлечены 18 генов. Она способствует формированию аритмии, появлению болей в области сердца, а в последующем — проявлениям сердечной недостаточности.

• Полиморфизм С677Т гена MTHFR, участвующий в регуляции обмена гомоцистеина, может служить фактором риска и генетическим маркером тяжести артериальной гипертензии.

• Роль генетических факторов в функционировании сердечно-сосудистой системы связана с влиянием мутаций на структуру или активность веществ, участвующих в регуляции артериального давления. Определённые сочетания аллельных вариантов генов и факторов окружающей среды могут приводить к изменению функционирования всей сердечно-сосудистой системы в целом.

• В развитие гипертрофии (увеличение клеток) миокарда вовлечены 18 генов. Она способствует формированию аритмии, появлению болей в области сердца, а в последующем — проявлениям сердечной недостаточности.

• Генетический полиморфизм влияет на метаболизм, транспорт и лекарственные мишени препаратов и может быть использован для прогнозирования ответа организма человека на лечение.

Заключение

Геномика стала неотъемлемой частью современной кардиологии. Развитие геномных технологий позволило значительно расширить наше понимание генетической архитектуры ССЗ, открыть новые возможности для их диагностики, профилактики и лечения. В будущем, геномная медицина, вероятно, станет основой для персонализированного подхода к ведению пациентов с ССЗ, позволяя разрабатывать индивидуальные программы профилактики и лечения, основанные на генетическом профиле каждого человека. Однако, для реализации этого потенциала необходимы дальнейшие исследования, направленные на выявление новых генетических факторов, влияющих на ССЗ, и разработку эффективных способов их клинического применения.

Из всего, что было сказано в данной работе, можно прийти к выводу о том, что генам и генонам в будущем можно будет повысить резистентность к воздействую внешней среды и другим факторам, которые оказывают не благоприятное влияние на организм человека. Также возможно даже заменить или вывести неустойчивые и слабые из цепочки ДНК. Всё это способствует к улучшению качества жизни и позволит обеспечить здоровье последующим поколениям. Данная теория может позволить медицине выйти на новый уровень в сфере продления и поддержания жизни людей.