Сетевое издание
Международный студенческий научный вестник
ISSN 2409-529X

ПАРАМЕТРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ ОРГАНИЗМА, ОТРАЖАЮЩИЕ УРОВЕНЬ КАРБОНИЛЬНОГО СТРЕССА

Вавилов Н.В. 1
1 ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет им. акад. Е.А. Вагнера» Минздрава России
Во всём мире активно обсуждается роль мужского фактора в структуре бесплодных браков, ВОЗ за 30 летний период регистрирует снижение показателей качества эякулята. Данный эффект можно связать с ускорением темпа жизни, урбанизацией, ухудшением экологической обстановки и т.д., что влечёт за собой декомпенсацию систем гомеостаза организма. Одним из факторов, имеющим такую многофакторную природу является оксидативный стресс, наиболее ранним маркёром которого являются продукты перекисного окисления белковых молекул. В статье предложены параметры, по которым можно оценивать уровень карбонильного стресса в биологических жидкостях организма и, в частности, представлены материалы собственных исследований крови здоровых доноров и спермоплазмы субфертильных мужчин. Установлено, что уровень кДНФн сыворотки крови здоровых доноров составил 1,24 ± 0,15 нмоль/мг белка, вклад кДНФо составляет 0,74 ± 0,11 нмоль/мг белка, а аДНФн – 0,37 ± 0,07 нмоль/мг белка. Таким образом, суммарная концентрация окисленных белков сыворотки крови здоровых доноров равна 2,35 ± 0,11 нмоль/мг белка. Выявлено, что на долю аДНФн приходится 16 % окисленных белков, на кДНФо – 31,5 % и 52,5 % на кДНФн. Соотношение окисленных белков сыворотки крови здоровых доноров кДНФн:кДНФо:аДНФн составляет 1:2:3,3. Концентрация карбонилов в спермоплазме ровна 2,01 ± 0,10 для аДНФо, 0,80 ± 0,04 – кДНФн, 0,43 ± 0,02 – кДНФо и 0,23 ± 0,01 нмоль/мг белка для аДНФн. Суммарная концентрация окисленных белков составляет 3,47 ± 0,4 нмоль/мг белка. Соответственно на долю аДНФн приходится 6,5 %, на долю кДНФо – 12,5 %, на долю кДНФн – 23 % и на долю аДНФо 58 % окисленных белков. Соотношение окисленных белков спермоплазмы субфертильных доноров аДНФн:кДНФо:кДНФн:аДНФо составляет 1:1,9:3,5:8,7.
сыворотка крови
спермоплазма
эякулят
окислительная модификация белков
ДНФГ
1. Вавилов Н.В., Годовалов А.П. Взгляд на клиническое значение окисленно модифицированных белков& // Современные научные исследования и& разработки. 2017. Т. 2. № 1 (9). С. 36-39.
2. Вавилов Н.В., Шилов Ю.И. Модификация метода оценки окислительной модификации белков& // Медицинская иммунология. 2017. Т. 19. № SV. С. 360.
3. Годовалов А.П., Карпунина Т.И. Микробиота эякулята мужчин с& бесплодием в& условиях крупного промышленного города& // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. Социальные, гуманитарные, медико-биологические науки.& – 2015.& – Т. 17, № 5-2.& – С. 338-343.
4. Тарусов Б.Н., Поливода А.И., Журавлёв А.И. Радиобиология, т. 1, 1961.& – 150-151с,.
5. Berlett BS, Stadtman ER. Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress. J Biol Chem 1997;272:20313– 6.
6. Esteves S.C. Clinical relevance of routine semen analysis and controversies surrounding the 2010 World Health Organization criteria for semen examination // Clinical relevance of routine semen analysis and controversies& – 2014.& – Vol. 40 (4)& – P. 443-453
7. Godovalov A.P., Karpunina T.I. Мicrobiological and morpho-functional features of ejaculate from infertile men with asymptomatic bacteriospermia // Международный научно-исследовательский журнал.& – 2016.& – № 9-3 (51).& – С. 34-38.
8. Goldstein S., Meyerstein D., Czapski G. The Fenton reagents // Free Radical Biology and Medicine.& – 1993.& – Vol. 15(4).& – P. 435–445.
9. Reznick A.Z., Packer L. Oxidative Damage to Proteins: Spectrophotometric Method for Carbonyl Assay // Methods in enzymology.& – Vol. 233.& – 1994.& – Р. 357-363.
10. Sheth J.J. Genoprotective Effect of Indian Gentian in Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM): Comet Assay, Sister Chromatid Exchange and Protein Oxidation Studies // Int. J. Hum. Genet.& – 2011.& – Vol. 11(2)& – Р. 83-88.

Окислительный стресс (оксидативный стресс) – процесс повреждения клетки в результате окисления, с последующим распространением повреждения во внеклеточную среду. Изучение данного вопроса началось с середины 50х годов прошлого века, когда основным маркёром свободно-радикальных процессов служили продукты перекисного окисления липидов [4]. Под действием оксидативного стресса, так же меняется нативная конформация белковых молекул, вплоть до фрагментации, что отражается на их функции. Окислительная модификация белков (ОМБ) – одно из основных последствий протекания свободно-радикального окисления в живых системах, опосредованное воздействием активных форм кислорода и реактивных форм азота [1].

В результате свободно-радикальных процессов могут образоваться активные формы кислорода (АФК) и активные формы азота. Эти процессы стимулируют экзогенные факторы, такие как фотохимический смог, озон, пестициды, ксенобиотики, ультрафиолетовое излучение, х– и γ–лучи (рис. 1). Кроме этого существенный вклад вносят эндогенные факторы: продукты метаболизма митохондрий, продукты микросомальных реакций, катализируемых цитохромом P450, реакции катализируемые металлами, продукты метаболизма аргинина, продукция нейтрофилами и макрофагами, при воспалении АФК, ведущие к ОМБ [5]. В человеческом организме наиболее распространены реакции Фентона и Габера-Вейса, генерирующие гидроксил-радикалы [8].

vav1.tif

Рис. 1. Инициация свободно-радикальных процессов

В настоящее время роль мужского фактора в развитии бесплодия существенно занижена. В России зафиксировано от 10 % до 17 % бесплодных супружеских пар (4-4,5 млн.) [3, 7]. Из рекомендаций ВОЗ к качеству эякулята следует, что за последние 30-40 лет требования к некоторым показателям спермограммы снизились на 25-35 % [6]. Это заставляет задуматься о поиске причин и механизмов повреждения сперматозоидов. Одним из таких механизмов, вероятно, может являться воздействие АФК или реактивных соединений азота на биополимерные составляющие сперматозоидов, такие как нуклеиновые кислоты, белки, углеводы и на липиды. Считается, что наиболее массивному повреждению подвергаются белковые молекулы, которые под воздействием свободных радикалов фрагментируются, с образованием карбонильных производных или же формируются внутримолекулярные сшивки, что влечёт за собой нарушения конформационной модели и сказывается на функции белков.

Цель исследования – опробовать методику определения ОМБ на сыворотке крови от доровых доноров и в спермоплазме от субфертильных доноров, оценив при этом уровень карбонильного стресса.

Материалы и методы исследования

Проведено лабораторное исследование образцов эякулята 92 мужчин, состоящих в бесплодном браке, средний возраст которых составил 37,7 ± 0,7 года. Взятие материала проводили согласно стандартизованным методикам, предложенным экспертами ВОЗ (2010). Исследована сыворотка периферической крови 10 практически здоровых доноров. Для оценки ОМБ использовали следующую методику [2]. Реакцию проводили с 0,1M раствором 2,4-динитрофенилгидразина (ДНФГ). В контрольной пробе использовали растворитель ДНФГ. Известно, что для алифатических альдегид-динитрофенилгидразонов (аДНФо) нейтрального характера спектр поглощения зарегистрирован при 260 нм, основного характера – 530 нм (аДНФн). Для алифатических кетон-ДНФ нейтрального характера спектр поглощения составляет 365 нм (кДНФн), основного характера – 430 нм (кДНФо). Содержание карбонилов вычисляли из пика поглощения при соответствующих длинах волн. Концентрацию окисленных белков выражали в нмоль/мг общего белка. Общий белок в спермальной жидкости определяли с помощью биуретовой реакции (Вектор-Бест, Новосибирск).

Статистический анализ результатов проводили с использованием методов описательной статистики и t-критерия Стьюдента для парных данных.

Результаты исследования и их обсуждение

В ходе исследований установлено, что уровень кДНФн сыворотки крови здоровых доноров составил 1,24 ± 0,15 нмоль/мг белка (контрольная проба 0,56 ± 0,12 нмоль/мг белка), что соответствует результатам, полученным как в классическом варианте реакции (p gt;0,05) [9], так и литературным данным [10]. Уровень кДНФо составляет 0,74 ± 0,11 нмоль/мг белка (контрольная проба 0,36 ± 0,07 нмоль/мг белка), а аДНФн – 0,37 ± 0,07 нмоль/мг белка (контрольная проба 0,25 ± 0,05 нмоль/мг белка). Таким образом, суммарная концентрация окисленных белков сыворотки крови здоровых доноров составляет 2,35 ± 0,11 нмоль/мг белка (рис. 2). Выявлено, что на долю аДНФн приходится 16 %, на долю кДНФо – 31,5 %, на долю кДНФн – 52,5 % окисленных белков. Соотношение окисленных белков сыворотки крови здоровых доноров кДНФн: кДНФо: аДНФн составляет 1: 2: 3,3. По техническим причинам измерение аДНФо сыворотки крови не производилось на данном этапе исследований.

Установлено, что концентрация карбонилов в спермоплазме составила 2,01 ± 0,10 для аДНФо, 0,80 ± 0,04 – кДНФн, 0,43 ± 0,02 – кДНФо и 0,23 ± 0,01 нмоль/мг белка для аДНФн. Следовательно, суммарная концентрация окисленных белков составляет 3,47 ± 0,4 нмоль/мг белка (рис. 2). Соответственно на долю аДНФн приходится 6,5 %, на долю кДНФо – 12,5 %, на долю кДНФн – 23 % и на долю аДНФо 58 % окисленных белков. Соотношение окисленных белков спермоплазмы субфертильных доноров аДНФн: кДНФо: кДНФн: аДНФо составляет 1: 1,9: 3,5: 8,7.

vav2.wmf

Рис. 2. Спектр окисленных белков сыворотки крови и спермоплазмы

Выводы

1. Предложенный метод оценки ОМБ пригоден для оценки карбонильного стресса эякулята.

2. Показатели карбонильного стресса эякулята ниже, чем показатели сыворотки крови, что говорит о более активной работе антиоксидантов в данной биологической жидкости.

3. При оценке уровня карбонильного стресса следует использовать параметры относительного содержания производных ОМБ и параметры соотношения фракций относительно друг друга.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Администрации Пермского края в рамках научного проекта «р_а 16-44-590429».


Библиографическая ссылка

Вавилов Н.В. ПАРАМЕТРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ ОРГАНИЗМА, ОТРАЖАЮЩИЕ УРОВЕНЬ КАРБОНИЛЬНОГО СТРЕССА // Международный студенческий научный вестник. – 2017. – № 4-6. ;
URL: https://eduherald.ru/ru/article/view?id=17557 (дата обращения: 27.11.2022).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074